[發明專利]Gal4溫敏型突變體、重組表達載體、溫度調控系統及其應用

有效

• 申請號: 201711403958.5
• 申請日: 2017-12-22
• 公開（公告）號: CN107987138B
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發明（設計）人: 于洪巍;周萍萍;葉麗丹
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C07K14/395
• 分類號: C07K14/395;C12N15/31;C12N15/81;C12N1/19;C12P23/00;C12P5/02;C12R1/865
• 代理公司: 杭州裕陽聯合專利代理有限公司 33289
• 代理人: 姚宇吉

本發明提供Gal4溫敏型突變體，及利用其該突變體在釀酒酵母中構建溫度調控系統及其應用。利用Gal4溫敏型突變體構建的溫度調控操作簡單，無需添加誘導劑/抑制劑，實現對代謝流的精細調控。有利于其它對細胞毒性大的物質的生產。

技術領域

本發明屬于基因工程與酶工程領域，具體涉及一種定向進化改造酵母轉錄激活蛋白Gal4，以及利用改造后的Gal4突變蛋白構建溫度調控的表達系統及其應用。

背景技術

隨著代謝工程和合成生物學的發展，通過在釀酒酵母中表達異源基因來生產一些化學品變得越來越熱門。但途徑中的蛋白酶過表達以及外源代謝途徑的中間產物積累，常常對宿主細胞造成毒害作用從而影響細胞生長。因此開發精確調控外源基因的表達至關重要。

目前半乳糖調節網絡是釀酒酵母中被用于基因表達的一個常用有效的系統，在這個系統中Gal4能識別GAL基因啟動子的上游激活序列(UASg),激活上述基因的轉錄。另外這個系統中GAL4的轉錄受到外界碳源的緊密調節，酵母細胞在沒有半乳糖的培養環境中生長時，Gal80可以和Gal4特異性結合，阻止Gal4蛋白與GAL基因啟動子區的結合，從而抑制GAL基因的表達。但是由于該誘導劑在發酵過程中會被消耗，需要不時補加，且價格比較昂貴，因此這種策略在大規模發酵中并不經濟。有研究通過敲除GAL80，使GAL4的轉錄僅受到高葡萄糖抑制，低葡萄糖誘導。并成功地利用該系統在釀酒酵母中構建了可控的類異戊二烯高效合成途徑。但是，利用葡萄糖進行長途徑的表達調控在實際操作中并不嚴謹，常常會出現泄漏表達。而且在高密度發酵中工藝復雜，基因表達很難實現人為的控制。因此通過蛋白工程手段對Gal4進行進一步的改造，使它變成一種不借助于誘導劑/抑制劑，而是通過感知溫度培養因子的變化來實現對代謝途徑更加精細的調控，最終使菌體的生長與產物的積累相協調具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是通過定向進化的方法來獲得溫敏型的Gal4蛋白突變體，以實現在釀酒酵母中構建溫度調控系統為目的并將其應用到代謝產品的生產中。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

本發明提供了Gal4溫敏型突變體，所述突變體的氨基酸序列選自以下序列：

序列表中SEQ ID NO:6的氨基酸序列；

序列表中SEQ ID NO:7的氨基酸序列；

序列表中SEQ ID NO:8的氨基酸序列；

序列表中SEQ ID NO:9的氨基酸序列；

序列表中SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

其中序列表中SEQ ID NO:6的氨基酸序列命名Gal4M9，相對于野生型其第69位亮氨酸變成了脯氨酸，第356位丙氨酸變成了蘇氨酸；序列表中SEQ ID NO:7的氨基酸序列命名Gal4M61，相對于野生型其第385位纈氨酸變成了天冬氨酸；序列表中SEQ ID NO:8的氨基酸序列命名Gal4M63，相對于野生型其第63位精氨酸變成了甘氨酸，第194位天冬酰胺變成了天冬氨酸；序列表中SEQ ID NO:9的氨基酸序列命名Gal4M153，相對于野生型其第196位苯丙氨酸變成了亮氨酸，第297位谷氨酸變成了甘氨酸，第361為亮氨酸變成了絲氨酸；序列表中SEQ ID NO:10的氨基酸序列命名Gal4M414，相對于野生型其第208位絲氨酸變成了脯氨酸。

進一步，編碼Gal4溫敏型突變體的核苷酸序列選自下列序列：

SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；