[發(fā)明專利]NGN2介導(dǎo)成年鼠嗅鞘細(xì)胞直接重編程為神經(jīng)元的方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711402625.0
• 申請(qǐng)日: 2017-12-22
• 公開（公告）號(hào): CN108192924A
• 公開（公告）日: 2018-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何成;蘇志達(dá);袁一旻;孫秀
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/867
• 分類號(hào): C12N15/867;C12N5/10;A61K35/30;A61P25/00
• 代理公司: 上海元一成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 趙青

1.NGN2介導(dǎo)成年鼠嗅鞘細(xì)胞直接重編程為功能性神經(jīng)元的方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、成年小鼠OECs原代培養(yǎng)

成年小鼠鼻中隔兩側(cè)的粘膜以及鼻甲表面粘膜放入4℃的解剖液中，在顯微鏡下剝離粘膜外邊的薄膜，剪碎，或取成年小鼠嗅球的嗅神經(jīng)層和嗅小球?qū)硬糠旨羲?；剪碎后，?.25％的胰酶在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化15min，加入DF12-15％FBS培養(yǎng)基終止消化，離心機(jī)800rpm離心4min后吸去上清，重新加入適量培養(yǎng)液后反復(fù)吹打單細(xì)胞懸液，然后種到不涂膠的T25培養(yǎng)瓶中；36h后將懸浮的細(xì)胞液移到新的不涂膠的T25培養(yǎng)瓶中，再過36h后，將沒有貼壁的細(xì)胞懸液種在涂有0.1mg/ml L-型多聚賴氨酸的培養(yǎng)板上；隨后在嗅鞘細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入2uM的Forskolin和10ng/ml的bFGF；在細(xì)胞培養(yǎng)過程中每隔兩天換一次液，一周左右即可傳代，傳代1～2次后用于細(xì)胞誘導(dǎo)；

B、NGN2質(zhì)粒構(gòu)建和慢病毒包裝

利用PCR儀擴(kuò)增含有NGN2的目的基因片段，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，將攜帶有人源性NGN2基因的cDNA片段構(gòu)建到第三代慢病毒載體pCSC-SP-IRES-GFP上，獲得pCSC-SP-PW-NGN2-IRES-GFP，簡(jiǎn)稱為NGN2慢病毒質(zhì)粒；病毒包裝時(shí)，在DMEM中將NGN2慢病毒質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒pMDL，VSV-G，和pREV按照4：1：1：1混合，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞的方法產(chǎn)生出攜帶有NGN2-GFP基因的復(fù)制缺陷型慢病毒，在轉(zhuǎn)染后第10-15h換成培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞的培液，之后在第24h收集一次病毒上清，在第48h收集第二次病毒上清，將兩次收集的病毒液混合離心，經(jīng)濾器過濾后可直接用于感染OECs；

C、OECs重編程為神經(jīng)元

將OECs傳代后種在鋪有PLL及基質(zhì)膠的細(xì)胞培養(yǎng)板上或者細(xì)胞玻片上，待細(xì)胞完全貼壁后培養(yǎng)2-3天，將離心純化后的慢病毒添加6μg/ml聚凝胺polybrene之后加入到培養(yǎng)孔板中感染OECs，10-12h后換成OECs培養(yǎng)液，待細(xì)胞感染病毒約48h后換成神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在此誘導(dǎo)培養(yǎng)基中含有DMEM/DF12、Neurobasal溶液、0.8％N-2、0.4％B27、Forskolin 2uM、BMP通路抑制劑Dorsomorphin 1μM、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10ng/ml及1％青鏈霉素，每隔一天更換一次培養(yǎng)基。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的NGN2介導(dǎo)成年鼠嗅鞘細(xì)胞直接重編程為功能性神經(jīng)元的方法，其特征在于，所述的成年小鼠取自成年C57/BL6J小鼠。

3.一種采用如權(quán)利要求1或2所述的方法從成年小鼠OECs重編程得到的神經(jīng)元樣細(xì)胞。

4.一種采用如權(quán)利要求3所述的從成年小鼠OECs重編程得到的神經(jīng)元樣細(xì)胞在制備治療脊髓損傷的藥物中的應(yīng)用。