[發明專利]NGN2介導成年鼠嗅鞘細胞直接重編程為神經元的方法及其應用

在審

• 申請號: 201711402625.0
• 申請日: 2017-12-22
• 公開（公告）號: CN108192924A
• 公開（公告）日: 2018-06-22
• 發明（設計）人: 何成;蘇志達;袁一旻;孫秀
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10;A61K35/30;A61P25/00
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 趙青

1.NGN2介導成年鼠嗅鞘細胞直接重編程為功能性神經元的方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、成年小鼠OECs原代培養

成年小鼠鼻中隔兩側的粘膜以及鼻甲表面粘膜放入4℃的解剖液中，在顯微鏡下剝離粘膜外邊的薄膜，剪碎，或取成年小鼠嗅球的嗅神經層和嗅小球層部分剪碎；剪碎后，用0.25％的胰酶在37℃細胞培養箱中消化15min，加入DF12-15％FBS培養基終止消化，離心機800rpm離心4min后吸去上清，重新加入適量培養液后反復吹打單細胞懸液，然后種到不涂膠的T25培養瓶中；36h后將懸浮的細胞液移到新的不涂膠的T25培養瓶中，再過36h后，將沒有貼壁的細胞懸液種在涂有0.1mg/ml L-型多聚賴氨酸的培養板上；隨后在嗅鞘細胞的培養液中加入2uM的Forskolin和10ng/ml的bFGF；在細胞培養過程中每隔兩天換一次液，一周左右即可傳代，傳代1～2次后用于細胞誘導；

B、NGN2質粒構建和慢病毒包裝

利用PCR儀擴增含有NGN2的目的基因片段，反轉錄得到cDNA，將攜帶有人源性NGN2基因的cDNA片段構建到第三代慢病毒載體pCSC-SP-IRES-GFP上，獲得pCSC-SP-PW-NGN2-IRES-GFP，簡稱為NGN2慢病毒質粒；病毒包裝時，在DMEM中將NGN2慢病毒質粒與包裝質粒pMDL，VSV-G，和pREV按照4：1：1：1混合，通過瞬時轉染HEK293T細胞的方法產生出攜帶有NGN2-GFP基因的復制缺陷型慢病毒，在轉染后第10-15h換成培養HEK293T細胞的培液，之后在第24h收集一次病毒上清，在第48h收集第二次病毒上清，將兩次收集的病毒液混合離心，經濾器過濾后可直接用于感染OECs；

C、OECs重編程為神經元

將OECs傳代后種在鋪有PLL及基質膠的細胞培養板上或者細胞玻片上，待細胞完全貼壁后培養2-3天，將離心純化后的慢病毒添加6μg/ml聚凝胺polybrene之后加入到培養孔板中感染OECs，10-12h后換成OECs培養液，待細胞感染病毒約48h后換成神經元誘導培養基，在此誘導培養基中含有DMEM/DF12、Neurobasal溶液、0.8％N-2、0.4％B27、Forskolin 2uM、BMP通路抑制劑Dorsomorphin 1μM、成纖維細胞生長因子10ng/ml及1％青鏈霉素，每隔一天更換一次培養基。

2.根據權利要求1所述的NGN2介導成年鼠嗅鞘細胞直接重編程為功能性神經元的方法，其特征在于，所述的成年小鼠取自成年C57/BL6J小鼠。

3.一種采用如權利要求1或2所述的方法從成年小鼠OECs重編程得到的神經元樣細胞。

4.一種采用如權利要求3所述的從成年小鼠OECs重編程得到的神經元樣細胞在制備治療脊髓損傷的藥物中的應用。