[發明專利]NGN2介導成年鼠嗅鞘細胞直接重編程為神經元的方法及其應用

在審

• 申請號: 201711402625.0
• 申請日: 2017-12-22
• 公開（公告）號: CN108192924A
• 公開（公告）日: 2018-06-22
• 發明（設計）人: 何成;蘇志達;袁一旻;孫秀
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10;A61K35/30;A61P25/00
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 趙青

本發明涉及細胞重編程領域，具體是NGN2介導成年鼠嗅鞘細胞直接重編程為功能性神經元的方法，并將重編程所得神經元用于移植治療脊髓損傷。本發明首次發現單獨應用Neurogenin 2(NGN2)這一個轉錄因子在兩周時間內即可將OECs重編程為神經元。該技術體系的建立，將會對移植自體細胞誘導所得神經元治療脊髓損傷提供有力技術支持。

技術領域

本發明涉及細胞重編程技術領域，具體地說，是利用成年小鼠的成體嗅鞘細胞直接重編程為功能性神經元的方法。

背景技術

細胞移植已經成為治療脊髓損傷的一個重要手段。嗅鞘細胞(Olfactoryensheathing cells,OECs)移植技術經過多輪臨床研究被證實是在是足夠安全、可行的，它能夠通過改善脊髓損傷局部微環境來發揮神經保護功能，進而有利于神經功能恢復，但效果還不夠理想。脊髓損傷引起的主要病理變化是不可逆性局部神經元變性壞死和神經環路破壞，如何補充替代脊髓損傷局部變性丟失的神經元并重建局部神經環路是脊髓損傷治療的關鍵。近年來，細胞重編程技術(Reprogramming technique)的出現給整個生命科學和再生醫學帶來了革命性的變化。通過細胞重編程，我們可以在體外將體細胞直接轉分化為特定細胞類型。例如，成纖維細胞、星形膠質細胞或血管周細胞在體外通過直接重編程都可以不經歷干細胞或前體細胞的狀態而改變細胞的譜系，定向轉分化成神經元。OECs是嗅覺系統內一類特殊的膠質細胞，同時存在于中樞(嗅球)和外周(鼻粘膜)神經系統，兼具星形膠質細胞和雪旺細胞的一些生物學特征。相對于成纖維細胞，OECs的細胞譜系與神經元比較接近，理論上較容易被重編程為神經元。更重要的是，OECs在臨床上可以通過病人的鼻粘膜自身獲取并進行體外擴增。另外，成纖維細胞重編程時，為轉分化為神經元的細胞移植后不利于神經再生；而OECs重編程是，為被轉分化為神經元的OECs移植后也可以發揮促進神經再生修復的作用。因此，OECs應該是一種理想的重編程靶細胞對象。目前，有關嗅鞘細胞重編程為神經元并應用于移植治療脊髓損傷，尚無文獻報道。

發明內容

本發明的目的在于提供在體外建立將成年小鼠OECs重編程為功能性神經元的方法，并將重編程所得神經元用于移植治療脊髓損傷。

本發明的第一方面，提供NGN2(Neurogenin 2)介導成年鼠嗅鞘細胞直接重編程為功能性神經元的方法，包括以下步驟：

A、成年小鼠OECs原代培養

成年小鼠鼻中隔兩側的粘膜以及鼻甲表面粘膜放入4℃的解剖液中，在顯微鏡下剝離粘膜外邊的薄膜，剪碎，或取成年小鼠嗅球的嗅神經層和嗅小球層部分剪碎；剪碎后，用0.25％的胰酶在37℃細胞培養箱中消化15min，加入DF12-15％FBS培養基終止消化，離心機800rpm離心4min后吸去上清，重新加入適量培養液后反復吹打單細胞懸液，然后種到不涂膠的T25培養瓶中；36h后將懸浮的細胞液移到新的不涂膠的T25培養瓶中，再過36h后，將沒有貼壁的細胞懸液種在涂有L-型多聚賴氨酸(PLL，0.1mg/ml)的培養板上；隨后在嗅鞘細胞的培養液中加入2uM的Forskolin和10ng/ml的bFGF；在細胞培養過程中每隔兩天換一次液，一周左右即可傳代，傳代1～2次后用于細胞誘導；

B、NGN2質粒構建和慢病毒包裝

利用PCR儀擴增含有NGN2的目的基因片段，反轉錄得到cDNA，將攜帶有人源性NGN2基因的cDNA片段構建到第三代慢病毒載體(pCSC-SP-IRES-GFP)上，獲得pCSC-SP-PW-NGN2-IRES-GFP(簡稱為NGN2)慢病毒質粒；病毒包裝時，在DMEM中將NGN2慢病毒質粒與包裝質粒(pMDL，VSV-G，和pREV)按照4:1:1:1，通過瞬時轉染HEK293T細胞的方法產生出攜帶有NGN2-GFP基因的復制缺陷型慢病毒，在轉染后第10-15h換成培養HEK293T細胞的培液，之后在第24h收集一次病毒上清，在第48h收集第二次病毒上清，將兩次收集的病毒液混合離心，經濾器過濾后可直接用于感染OECs；