[發(fā)明專利]采用單鏈核苷酸片段體外修復(fù)HBA2基因突變的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711401007.4
• 申請日: 2017-12-14
• 公開（公告）號: CN108165581B
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫筱放;陳玉嫦;熊澤宇;宋兵
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院（廣州重癥孕產(chǎn)婦救治中心;廣州柔濟(jì)醫(yī)院）
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 郭煒綿

本發(fā)明公開了一種采用單鏈核苷酸片段體外修復(fù)HBA2基因突變的方法，包括以下步驟：根據(jù)HBA2基因突變位點上下游的序列設(shè)計sgRNA和ssODN；sgRNA的序列如SEQ.ID.NO.1所示，ssODN的序列如SEQ.ID.NO.2所示；構(gòu)建攜帶sgRNA和CRISPR/Cas9蛋白的質(zhì)粒，提取質(zhì)粒并沉淀濃縮；通過電轉(zhuǎn)儀將上述質(zhì)粒和ssODN轉(zhuǎn)入患者iPS細(xì)胞；利用流式儀分選EGFP熒光陽性克隆并接種細(xì)胞；測序鑒定單克隆，獲得打靶修復(fù)成功的細(xì)胞系。CRISPR/Cas9在基因定點修飾方面應(yīng)用廣泛，且制作簡單、作用高效。另外，利用長度為100bp的單鏈核苷酸片段合成簡易，而且能成功實現(xiàn)同源重組。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基因編輯技術(shù)，特別涉及一種采用單鏈核苷酸片段體外修復(fù)HBA2基因突變的方法。

背景技術(shù)

基因編輯是指對基因序列進(jìn)行編輯，實現(xiàn)對目標(biāo)DNA片段的敲除、插入等操作。基因打靶技術(shù)屬于基因編輯的一種方式，是指通過外源基因與基因組之間進(jìn)行同源重組，從而實現(xiàn)目標(biāo)DNA片段的基因定點修飾。這種方法是研究基因功能的重要手段之一，也被用于治療人類遺傳性疾病，是一種重要且熱門的生物技術(shù)。

早在20世紀(jì)70年代，在酵母的研究中人們就提出了基因打靶技術(shù)。1985年，Smithies等人在腫瘤細(xì)胞中第一次實現(xiàn)基因打靶，成功對β球蛋白基因進(jìn)行定位編輯。之后這項技術(shù)開始被應(yīng)用于各個領(lǐng)域，但是此時同源重組的效率是很低的，直到人工核酸內(nèi)切酶(engineered endonuclease，EEN)的出現(xiàn)。

ENN利用特異性的核酸序列定位，通過核酸內(nèi)切酶對目標(biāo)DNA進(jìn)行切割，并產(chǎn)生雙鏈斷裂(double strand breaks，DSB)。此時，基因組會啟動DNA自我修復(fù)機制：同源重組(homologous recombination，HR)和非同源末端重組(Non-homologous end joining，NHEJ)，通過這兩種方式實現(xiàn)對斷裂的雙鏈修復(fù)，從而達(dá)到基因編輯的目的。

目前有三類應(yīng)用較為廣泛的ENN。鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)是第一代ENN。鋅指是能夠結(jié)合DNA的一類蛋白質(zhì)，存在于許多轉(zhuǎn)錄因子中。ZFN是將鋅指蛋白與核酸內(nèi)切酶Fok I融合形成的核酸內(nèi)切酶，利用它可以在各種復(fù)雜基因組的特定位置制造DNA的雙鏈切口。

類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effectornuclease，TALEN)是第二代ENN，也是由DNA結(jié)合蛋白與核酸內(nèi)切酶Fok I融合而成。相對于ZFN，TALEN構(gòu)建簡單，特異性高。

2013年初，一種全新的第三代ENN，clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9出現(xiàn)，其優(yōu)勢為制作簡單、耗時短、成本低、作用高效，很快被運用廣泛。

CRISPR來自細(xì)菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機制，是規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)。Cas9蛋白含有兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域，可以分別切割DNA兩條單鏈。在噬菌體或是質(zhì)粒中，與間隔序列對應(yīng)的序列被稱為原間隔序列(protospacer)，而原間隔序列5′或是3′端延伸的幾個堿基序列非常保守，被稱為原間隔序列臨近基序(protospacer adjacentmotifs，PAM)，一般常見的形式為NGG。在基因編輯中，Type II系統(tǒng)為常用的CRISPR/Cas9類型，其原理是首先轉(zhuǎn)錄并剪切為成熟的cr-RNA，和tracRNA組成sgRNA，再與特異的Cas9蛋白形成核糖核蛋白復(fù)合物，通過識別NGG，crRNA的間隔序列與靶序列互補配對，引導(dǎo)Cas9蛋白對DNA實現(xiàn)定點雙鏈切割。