[發(fā)明專利]采用單鏈核苷酸片段體外修復(fù)HBA2基因突變的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711401007.4
• 申請日: 2017-12-14
• 公開（公告）號: CN108165581B
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫筱放;陳玉嫦;熊澤宇;宋兵
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院（廣州重癥孕產(chǎn)婦救治中心;廣州柔濟(jì)醫(yī)院）
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 郭煒綿

1.一種體外修復(fù)HBA2基因突變的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)根據(jù)HBA2基因突變位點上下游的序列設(shè)計sgRNA和單鏈核苷酸片段；

所述sgRNA的序列如SEQ.ID.NO.1所示，所述單鏈核苷酸片段的序列如SEQ.ID.NO.2所示；

(2)將sgRNA與其反向互補序列退火，與經(jīng)過BbsⅠ線性化的PX458質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建攜帶sgRNA和CRISPR/Cas9蛋白的質(zhì)粒，提取質(zhì)粒并沉淀濃縮；

(3)在生長密度為70-80％的患者iPS細(xì)胞中提前加入抗凋亡因子，然后消化細(xì)胞并收集，離心后再重復(fù)洗滌一遍；將混勻好的質(zhì)粒、ssODN及電轉(zhuǎn)液對細(xì)胞沉淀進(jìn)行充分重懸，使其處于單細(xì)胞均勻狀態(tài)后利用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電擊；再將細(xì)胞種于已經(jīng)被基質(zhì)膠處理過的培養(yǎng)皿中，加入抗凋亡因子繼續(xù)培養(yǎng)；

(4)將電轉(zhuǎn)48h后的細(xì)胞消化成單細(xì)胞，通過流式分選儀將EGFP陽性細(xì)胞分選出來，隨后將細(xì)胞以低密度種于已經(jīng)被基質(zhì)膠處理過的培養(yǎng)皿中，使其之后長成單克隆；

(5)測序鑒定單克隆，獲得打靶修復(fù)成功的細(xì)胞系。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(3)所述的抗凋亡因子是Y-27632。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(4)所述的低密度是指600個細(xì)胞/cm²。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步驟(5)是：在流式分選十余天后，單克隆細(xì)胞團(tuán)長得足夠大，挑取每個克隆團(tuán)塊的部分細(xì)胞，以其為模板進(jìn)行PCR，將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，突變位點C恢復(fù)成T的克隆則為陽性細(xì)胞系，表示成功體外修復(fù)HBA2基因突變。