[發明專利]血液直接PCR進行Taqman分型的方法

在審

• 申請號: 201711399642.3
• 申請日: 2017-12-22
• 公開（公告）號: CN108048547A
• 公開（公告）日: 2018-05-18
• 發明（設計）人: 劉書杰;肖哲;焦少灼;戚珠云;宮夏霓
• 申請（專利權）人: 美因健康科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6881
• 分類號: C12Q1/6881;C12Q1/686
• 代理公司: 北京高文律師事務所 11359
• 代理人: 徐江華

1.一種血液直接PCR進行Taqman分型的方法，其特征在于，包括如下步驟：血液粗處理，制得樣品—PCR擴增—Taqman分型鑒定；所述PCR擴增中采用強耐受性DNA聚合酶。

2.根據權利要求1所述的血液直接PCR進行Taqman分型的方法，其特征在于，所述血液粗處理的方法為向10μl全血中加入90μl細胞裂解液后室溫裂解30min；將裂解后的細胞液轉移到1.5ml離心管中，95℃加熱15min后，12，000×g，離心10min，取上清液至96孔板中作為樣品備用。

3.根據權利要求2所述的血液直接PCR進行Taqman分型的方法，其特征在于，所述細胞裂解液為50mmol/LTris-Cl PH8.0，150mmol/LNaCl。

4.根據權利要求1所述的血液直接PCR進行Taqman分型的方法，其特征在于，所述強耐受性DNA聚合酶選自

上述中的一種。

5.根據權利要求1所述的血液直接PCR進行TaqmanN分型的方法，其特征在于，所述PCR的體系如下：

。

6.根據權利要求5所述的血液直接PCR進行Taqman分型的方法，其特征在于，所述探針和引物包括如下3個位點的探針和引物，具體如下：

SNP位點1：

上游引物：AAAAGAAAACTGAGTGGGAGCAGTA

下游引物：TGCCCCAGCCTCTGCTT

探針1：TAGTATGGAAGAAATC

探針2：TAGTAGTATGGCAGAAAT

SNP位點2：

上游引物：TTAAAATGTGGTGGATGCACTGT

下游引物：CTGTCATGCACTTATATTTATCTAGTTTGAAG

探針1：AGATGCCACGTAGAAG

探針2：AGATGCCATGTAGAAGT

SNP位點3：

上游引物：ACAGGGCTGTGGGACAAGTC

下游引物：GGCGTTACAATTAAAGAGAGAGAGAGA

探針1：CATTCCGGTAAGCAG

探針2：ATTCCGGTAGGCAGC。

7.根據權利要求6所述的血液直接PCR進行Taqman分型的方法，其特征在于，所述引物、探針均由擎科生物技術有限公司(北京)合成。

8.根據權利要求5所述的血液直接PCR進行Taqman分型的方法，其特征在于，所述PCR條件如下：

①預變性：95℃，5min；

②變性：95℃，10s；

退火-延伸：60+1℃，60s，40個循環；

③12℃，forever；

退火溫度為：常規退火溫度+1℃；所述常規退火溫度是指本申請中所述引物在常規PCR下的溫度。

9.根據權利要求1所述的血液直接PCR進行Taqman分型的方法，其特征在于，所述Taqman分型鑒定是指使用Bio-tek讀取熒光值，利用Klustercaller軟件分析熒光數據，根據對照擴增結果，分型產生三種基因型。