[發(fā)明專利]血液直接PCR進(jìn)行Taqman分型的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711399642.3
• 申請(qǐng)日: 2017-12-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108048547A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉書(shū)杰;肖哲;焦少灼;戚珠云;宮夏霓
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 美因健康科技（北京）有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6881
• 分類號(hào): C12Q1/6881;C12Q1/686
• 代理公司: 北京高文律師事務(wù)所 11359
• 代理人: 徐江華

1.一種血液直接PCR進(jìn)行Taqman分型的方法，其特征在于，包括如下步驟：血液粗處理，制得樣品—PCR擴(kuò)增—Taqman分型鑒定；所述PCR擴(kuò)增中采用強(qiáng)耐受性DNA聚合酶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血液直接PCR進(jìn)行Taqman分型的方法，其特征在于，所述血液粗處理的方法為向10μl全血中加入90μl細(xì)胞裂解液后室溫裂解30min；將裂解后的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，95℃加熱15min后，12，000×g，離心10min，取上清液至96孔板中作為樣品備用。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的血液直接PCR進(jìn)行Taqman分型的方法，其特征在于，所述細(xì)胞裂解液為50mmol/LTris-Cl PH8.0，150mmol/LNaCl。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血液直接PCR進(jìn)行Taqman分型的方法，其特征在于，所述強(qiáng)耐受性DNA聚合酶選自

上述中的一種。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血液直接PCR進(jìn)行TaqmanN分型的方法，其特征在于，所述PCR的體系如下：

。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的血液直接PCR進(jìn)行Taqman分型的方法，其特征在于，所述探針和引物包括如下3個(gè)位點(diǎn)的探針和引物，具體如下：

SNP位點(diǎn)1：

上游引物：AAAAGAAAACTGAGTGGGAGCAGTA

下游引物：TGCCCCAGCCTCTGCTT

探針1：TAGTATGGAAGAAATC

探針2：TAGTAGTATGGCAGAAAT

SNP位點(diǎn)2：

上游引物：TTAAAATGTGGTGGATGCACTGT

下游引物：CTGTCATGCACTTATATTTATCTAGTTTGAAG

探針1：AGATGCCACGTAGAAG

探針2：AGATGCCATGTAGAAGT

SNP位點(diǎn)3：

上游引物：ACAGGGCTGTGGGACAAGTC

下游引物：GGCGTTACAATTAAAGAGAGAGAGAGA

探針1：CATTCCGGTAAGCAG

探針2：ATTCCGGTAGGCAGC。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的血液直接PCR進(jìn)行Taqman分型的方法，其特征在于，所述引物、探針均由擎科生物技術(shù)有限公司(北京)合成。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的血液直接PCR進(jìn)行Taqman分型的方法，其特征在于，所述PCR條件如下：

①預(yù)變性：95℃，5min；

②變性：95℃，10s；

退火-延伸：60+1℃，60s，40個(gè)循環(huán)；

③12℃，forever；

退火溫度為：常規(guī)退火溫度+1℃；所述常規(guī)退火溫度是指本申請(qǐng)中所述引物在常規(guī)PCR下的溫度。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血液直接PCR進(jìn)行Taqman分型的方法，其特征在于，所述Taqman分型鑒定是指使用Bio-tek讀取熒光值，利用Klustercaller軟件分析熒光數(shù)據(jù)，根據(jù)對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果，分型產(chǎn)生三種基因型。