[發(fā)明專利]血液直接PCR進(jìn)行Taqman分型的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711399642.3
• 申請日: 2017-12-22
• 公開（公告）號: CN108048547A
• 公開（公告）日: 2018-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉書杰;肖哲;焦少灼;戚珠云;宮夏霓
• 申請（專利權(quán)）人: 美因健康科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6881
• 分類號: C12Q1/6881;C12Q1/686
• 代理公司: 北京高文律師事務(wù)所 11359
• 代理人: 徐江華

本發(fā)明提供了一種血液直接PCR進(jìn)行Taqman分型的方法，包括如下步驟：血液粗處理，制得樣品—PCR擴(kuò)增—Taqman分型鑒定。本發(fā)明的方法直接PCR進(jìn)行Taqman分型，節(jié)省了提取DNA的步驟。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及Taqman分型方法，尤其涉及一種血液直接PCR進(jìn)行Taqman分型的方法。

背景技術(shù)

單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms)，是由于單個(gè)核苷酸改變而導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)。SNP在人類基因組中的發(fā)生頻率比較高，大約平均每1000個(gè)堿基中就有一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。有些SNP位點(diǎn)還會影響基因的功能，導(dǎo)致生物性狀改變甚至致病。單核苷酸多態(tài)性是研究人類家族和動(dòng)植物品系遺傳變異的重要依據(jù)，因此被廣泛用于群體遺傳學(xué)研究(如生物的起源、進(jìn)化及遷移等方面)和疾病相關(guān)基因的研究，在藥物基因組學(xué)、診斷學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中起重要作用。目前所涉及檢測SNP的技術(shù)中，無一例外的是以DNA為模板。由于樣品之間的巨大差異，DNA與RNA的分離提取過程也千差萬別，這項(xiàng)工作對于操作人員的技術(shù)熟練程度要求頗高。傳統(tǒng)分離提取技術(shù)由于要使用一些毒性較強(qiáng)的化學(xué)試劑，長期接觸，將對操作人員的身體造成不可逆的傷害，甚至在實(shí)驗(yàn)過程中造成直接的損害。同時(shí)，對于有大量樣品需要研究的人員，分離提取核酸則是一項(xiàng)勞動(dòng)量極大的工作。現(xiàn)在市場上核酸分離提取試劑盒已經(jīng)成熟，品牌眾多，但大致都相同。無論是硅膠膜柱離心式試劑盒還是磁珠法試劑盒，都需要大量的時(shí)間，且成本高昂。除試劑盒成本外，更是對實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備有特殊要求，磁珠法所采用的自動(dòng)化工作站就是非常典型的大型高價(jià)值設(shè)備，對實(shí)驗(yàn)室而言，是一項(xiàng)巨大的費(fèi)用支出。綜上，本發(fā)明以獨(dú)特的細(xì)胞裂解液對血液樣本進(jìn)行粗處理，進(jìn)行簡單的離心除雜后，便可進(jìn)行SNP分型。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)過程中所用聚合酶為強(qiáng)耐受性DNA聚合酶，其余試劑、耗材與正常SNP分型無異，所發(fā)明通用于所有使用TaqMan探針法進(jìn)行SNP分型的技術(shù)領(lǐng)域。

Taqman探針PCR反應(yīng)體系中含有一對雙標(biāo)記的探針和一對PCR引物,用兩種熒光染料Fam，Hex(Vic)分別標(biāo)記這兩種探針，TaqMan探針上有一個(gè)熒光發(fā)光基團(tuán)(reporter dye簡稱R基團(tuán))和一個(gè)熒光猝滅基團(tuán)(quencher簡稱Q基團(tuán))，完整的探針上的這兩個(gè)基團(tuán)靠的很近，R基團(tuán)發(fā)出的熒光在Q基團(tuán)的吸收波長范圍內(nèi)，則會被Q基團(tuán)吸收，因此不會產(chǎn)生熒光，當(dāng)探針與模板結(jié)合，上游引物(5’端的)延伸到探針結(jié)合的地方時(shí)，利用聚合酶(Taqpolymerase)的5’-3’的外切酶活性把探針降解，同時(shí)把R基團(tuán)從探針上游離下來，使它和猝滅集團(tuán)分開，這時(shí)就會產(chǎn)生熒光，最后通過終點(diǎn)讀板檢測信號來確定是否存在SNP位點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種血液直接PCR進(jìn)行Taqman分型的方法，本發(fā)明以細(xì)胞裂解液對血液進(jìn)行粗處理，進(jìn)行簡單的離心除雜后，便可進(jìn)行Taqman分型，避免了提取DNA的繁瑣步驟，本發(fā)明實(shí)驗(yàn)過程中所用聚合酶為強(qiáng)耐受性DNA聚合酶。

本發(fā)明的目的是通過以下方案實(shí)現(xiàn)：

一種血液直接PCR進(jìn)行Taqman分型的方法，包括如下步驟：血液粗處理，制得樣品—PCR擴(kuò)增—Taqman分型鑒定；所述PCR擴(kuò)增中采用強(qiáng)耐受性DNA聚合酶。

優(yōu)選地，所述血液粗處理的方法為向10μl全血中加入90μl細(xì)胞裂解液后室溫裂解30min；將裂解后的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，95℃加熱15min后，12，000×g，離心10min，取上清液至96孔板中作為樣品備用。

優(yōu)選地，所述細(xì)胞裂解液為50mmol/LTris-Cl PH8.0，150mmol/LNaCl。

優(yōu)選地，所述強(qiáng)耐受性DNA聚合酶選自選自