[發明專利]一種快速檢測辣椒褪綠病毒的血清學方法

在審

• 申請號: 201711398488.8
• 申請日: 2017-12-21
• 公開（公告）號: CN107918017A
• 公開（公告）日: 2018-04-17
• 發明（設計）人: 劉雅婷;賈志強;吳保為;高雪;陶宏征;李文貴;飛進強
• 申請（專利權）人: 云南農業大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 昆明合眾智信知識產權事務所53113
• 代理人: 康珉

技術領域

本發明涉及植物病毒的血清學檢測技術領域，具體涉及辣椒褪綠病毒的血清學檢測方法。

背景技術

番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)病毒是單鏈RNA病毒，屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)，是該科中唯一侵染植物的病毒屬。截止到目前，已報道該屬的病毒有29種，其中有11個確定種，18個暫定種。辣椒褪綠病毒(Capsicum chlorosis virus，CaCV)屬于番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)病毒中的一個暫定種。辣椒褪綠病毒(Capsicum chlorosis virus,CaCV)是一種危害農業生產的重要病毒，其基因組有3個單鏈RNA分子構成：S RNA編碼核殼體蛋白(NP)和非結構蛋白(NSs)；M RNA編碼糖蛋白前體(Gn/Gc)和非結構蛋白(NSm)；L RNA編碼依賴RNA的RNA多聚酶(RdRp)。

1999年，CaCV最早發現于澳大利亞，自然寄主為辣椒和番茄。隨后在澳大利亞東南部和西部也有報道，目前CaCV在東南亞的很多國家和地區均有報道，如中國大陸、泰國、印度、臺灣等地區。2002年，Chen等人在中國廣州市郊的花生上首次發現了CaCV，并指出該病毒能引起花生葉片產生黃斑、壞死斑，葉脈、莖及頂芽壞死，植株矮化。2002年，Zheng You Xiu等人從臺灣的蝴蝶蘭上發現了CaCV，感病葉片上出現褪綠斑。2013年，李婷婷等人在云南玉溪的番茄上發現了CaCV，在感病番茄的葉子上出現芽壞死，在番茄的果實上出現壞死環斑。因此，CaCV的傳播區域越來越廣，報道的寄主越來越多，給農業生產帶來了較大的危害。

目前，在番茄斑萎病毒屬病毒檢測中，常見的有血清學方法、分子生物學方法、電鏡檢測和生物學測定等方法。

分子生物學方法中常采用PCR(聚合酶鏈式反應，Polymerase Chain Reaction，PCR)和RT-PCR(逆轉錄聚合酶鏈式反應(Reverse transcription-PCR，RT-PCR)方法來檢測植物病毒。1996年，Weekes等人用RT-PCR方法成功的檢測到Tospovirus屬病毒，后來對RT-PCR又作了很多修改。2006年，Knierim等人用RT-PCR方法檢測到CaCV，并得到CaCV(CaCV-AIT株系)的全基因組。1992年，Higuchi等人首次報道了實時熒光定量PCR(Realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR)方法。目前，RTFQ-PCR技術在CaCV常規檢測方面應用不是很廣泛。RT-PCR方法是根據Tospovirus屬病毒NP基因序列的保守區域設計的，該基因在Tospovirus屬不同種之間的同源性較高，如果僅以NP基因設計引物檢測，遇到該屬幾種病毒復合侵染時則會出現假陽性，最終影響到我們的檢測結果。此外，分子生物學方法檢測周期長、成本較高，不利于大批量樣品的檢測。

電鏡檢測可以確定病毒形態、大小、結構、內含體組成和亞結構，判斷病毒是否存在。2007年，Chen等人用電鏡技術檢測病株細胞中特征性的顆粒，從而鑒定了CaCV(CaCV-AIT株系)，并認為電鏡技術是鑒定CaCV的一種輔助方法。2008年，Zheng等人用電鏡技術檢測了感病蝴蝶蘭(Phalaenopsis orchids.)中CaCV的顆粒，結果發現CaCV為球狀粒體，病毒直徑70–100nm。CaCV的粒子形狀與Tospovirus的其他病毒的粒子形態極為相似，病毒直徑相差較小。通過電鏡觀察，依據病毒粒子的形狀和大小可以判斷到病毒的科或屬，但不能確定到種，因此，電鏡檢測不能準確鑒定CaCV病毒。此外，電鏡檢測需要專門的設備，檢測成本高，該檢測方法不利于推廣。

指示植物法檢測病毒是比較傳統的生物學檢測方法，生物學測定是通過汁液摩擦接種指示植物進行鑒定，常用的指示植物有本氏煙、心葉煙、普通煙、矮牽牛、長春花等。但該方法也有很多局限性，如指示植物種類有限，許多其他病毒也可侵染指示植物并表現出相似的癥狀，同種病毒的不同株系間產生的癥狀有差異，復合侵染及病毒衛星RNA會影響病毒癥狀的表現，病毒常會產生潛隱癥狀，不同氣候條件可改變癥狀表現等，因此生物學檢測方法并不能作為Tospovirus屬病毒檢測的唯一依據，還需采用血清學和分子生物學方法等技術進一步確認病毒的種類。