[發(fā)明專利]一種快速檢測辣椒褪綠病毒的血清學(xué)方法

在審

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• 申請日: 2017-12-21
• 公開（公告）號: CN107918017A
• 公開（公告）日: 2018-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉雅婷;賈志強(qiáng);吳保為;高雪;陶宏征;李文貴;飛進(jìn)強(qiáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 昆明合眾智信知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所53113
• 代理人: 康珉

1.一種快速檢測辣椒褪綠病毒的血清學(xué)方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)樣品的研磨：用pH 7.4的10×PBST緩沖液對樣品研磨，每個樣品加700μl pH 7.4的10×PBST緩沖液；研磨后低溫離心，離心條件為10000rpm，4℃，3min；同時，取健康樣品作為陰性對照，取純化后的濃度為200μg/ml CaCV NP蛋白稀釋液為陽性對照，同時每個96孔酶標(biāo)板中留3個空白對照，空白對照不加抗原，直接用pH 7.4的10×PBST緩沖液代替；

(2)包被：將樣品離心后的上清液加入酶標(biāo)板中，每孔加入200μl，每個樣品重復(fù)3次，4℃過夜或37℃溫育2-3h；

(3)封閉：將已包被的酶標(biāo)板用洗滌液洗3次，每孔加入200μl封閉液，37℃溫育1h，然后用洗滌液洗滌3次；所述洗滌液為pH 7.4的10×PBST緩沖液；所述封閉液為含0.05g/ml BSA的pH 7.4的10×PBST緩沖液；

(4)一抗的孵育：在封閉好的酶標(biāo)板中每孔加入200μl一抗稀釋液，37℃孵育1h，然后用洗滌液洗滌3次，所述一抗稀釋液由CaCV NP多克隆抗體與抗體稀釋液按CaCV NP多克隆抗體︰抗體稀釋液的體積比為1:4000混合而成，所述抗體稀釋液為含0.03g/ml的BSA的pH 7.4的10×PBST緩沖液；所述洗滌液為pH 7.4的10×PBST緩沖液；

(5)二抗的加入：每孔加入200μl二抗稀釋液，37℃溫育1h，溫育結(jié)束后用洗滌液洗滌4次；所述二抗稀釋液由辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗與抗體稀釋液以1︰5000體積比的比例稀釋后的溶液，所述抗體稀釋液為含0.03g/ml BSA的pH 7.4的10×PBST緩沖液；所述洗滌液為pH 7.4的10×PBST緩沖液；

(6)顯色反應(yīng)：每孔加入TMB顯色底物溶液100μl，置24℃下放置30min；

(7)終止：每孔加入顯色終止液50μl，然后在酶標(biāo)儀上測定各孔的OD 450nm吸光值，待陽性對照呈現(xiàn)黃色而陰性對照未顯色時，進(jìn)行判定：取陰性對照OD 450nm吸光值的2.5倍為臨界值，樣品的OD 450nm吸光值≥2.5倍為陽性即樣品感染了辣椒褪綠病毒，樣品的OD 450nm吸光值＜2.5倍為陰性,所述顯色終止液為用無菌水配制的濃度為2mol/L的硫酸溶液。