[發明專利]一種唐古特大黃查爾酮合酶Rt-CHS1基因、蛋白質及克隆方法

在審

• 申請號: 201711394028.8
• 申請日: 2017-12-21
• 公開（公告）號: CN108070575A
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發明（設計）人: 胡延萍;李毅;王莉;王鈞;錢前
• 申請（專利權）人: 中國科學院西北高原生物研究所
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/10
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 劉奇

本發明涉及一種唐古特大黃查爾酮合酶Rt?CHS1基因、蛋白質及克隆方法，具體涉及生物基因克隆技術領域，采用RT?PCR與RACE技術相結合的方法，對唐古特大黃Rt?CHS1基因進行了研究，首次從唐古特大黃根中克隆得到Rt?CHS1基因cDNA全長序列，并對其所編碼的氨基酸序列進行了分析。本發明為進一步研究唐古特大黃Rt?CHS1基因的表達、調控奠定了基礎，為Rt?CHS1基因參與唐古特大黃蒽醌類合成及調控機制研究提供參考，同時也為蓼科植物CHS1基因功能和進化研究提供了新的背景資料。另外，唐古特大黃Rt?CHS1基因的克隆，對提高唐古特大黃中蒽醌類化合物含量和藥材質量具有重要意義。

技術領域

本發明屬于生物基因克隆技術領域，具體涉及一種唐古特大黃查爾酮合酶Rt-CHS1基因、蛋白質及克隆方法。

背景技術

唐古特大黃(Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.)為蓼科(Polygonaceae)大黃屬(Rheum L.)多年生草本植物，分布在西藏東部、青海、甘肅，生于海拔1700-4300米山坡林緣、灌叢中及半陰坡石堆中，是青藏高原特有物種。其干燥根及根莖入藥，性寒，味苦；具有瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀通經，利濕退黃之功效；為《中華人民共和國藥典》(2015)中記載的三種“正品大黃”之一。

對于唐古特大黃而言，其化學成分包括蒽醌類、芪類、苯丁酮類和鞣質等，蒽醌類化合物是唐古特大黃重要的有效成分，其含量測定是評價唐古特大黃藥材品質優劣的重要指標。蒽醌類化合物主要包括大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素和大黃素甲醚等，總量約3～5％，具有瀉下、抗菌和抗腫瘤等功效。蒽醌類化合物是聚酮化合物的衍生物，其合成主要由植物III型聚酮化合物合酶催化的聚酮途徑完成。聚酮化合物合酶作為植物體內蒽醌類化合物合成途徑起始階段的一種限速酶，其研究已成為近年來植物生理生化和分子生物學領域研究的熱點之一。聚酮化合物合酶即查爾酮合酶超家族，包括查爾酮合酶(Chalconesynthase,CHS)、芪合成酶(Stilbene synthase,STS)、苯甲酮合酶(Benzalacetonesynthase,BAS)等，其同源性較高，氨基酸序列相似性達60-70％。

目前，CHS基因在矮牽牛、蘭花、擬南芥等植物上已經成功克隆，關于唐古特大黃查爾酮合酶基因的報道甚少，尚未見唐古特大黃中CHS基因克隆及其編碼的蛋白質氨基酸序列分析方面的報道。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種唐古特大黃查爾酮合酶Rt-CHS1基因的克隆方法及引物序列，預測唐古特大黃Rt-CHS1編碼的蛋白質氨基酸序列及其蛋白質性質。本發明填補了唐古特大黃Rt-CHS1基因序列尚未見報道的空白，將為唐古特大黃蒽醌類化合物合成途徑研究奠定基礎。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種唐古特大黃查爾酮合酶Rt-CHS1基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

優選的，所述基因的開放閱讀框的長度為1179bp。

本發明還提供了一種表達該基因的蛋白質，所述蛋白質的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本發明還提供了一種唐古特大黃查爾酮合酶Rt-CHS1基因的克隆方法，包括以下步驟：

1)從唐古特大黃中提取總RNA；

2)以步驟1)得到的總RNA為模板進行反轉錄獲得cDNA；

3)根據蓼科其他植物查爾酮合酶基因序列設計同源引物，以步驟2)得到的cDNA為模板，進行PCR擴增，回收PCR產物；

4)將步驟3)得到的PCR產物測序，獲得Rt-CHS1基因片段；