[發明專利]對銅綠假單胞菌-煙曲霉菌混合生物被膜抑制作用的研究方法

在審

• 申請號: 201711388694.0
• 申請日: 2017-12-21
• 公開（公告）號: CN108130358A
• 公開（公告）日: 2018-06-08
• 發明（設計）人: 孔晉亮;李更森;羅勁;王可;蔡雙啟;陳泉芳;盧樺崧
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06;C12R1/385;C12R1/68
• 代理公司: 北京卓嵐智財知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11624
• 代理人: 任漱晨

本發明提供了一種密對銅綠假單胞菌?煙曲霉菌混合生物被膜抑制作用的研究方法，包括以下步驟：煙曲霉孢子懸液的制備；銅綠假單胞菌野生菌株及其缺陷菌株菌液的制備挑取銅綠假單胞菌野生菌株單菌落及銅綠假單胞菌密度感應缺陷菌株單菌落，分別接種于培養基中，再稀釋；體外靜止兩種混合生物被膜模型的建立實驗分為6組，每組接種于細胞培養板，其中每孔已事先各放置圓形玻璃細胞爬片，再將野生型銅綠假單胞菌液及銅綠假單胞菌密度感應缺陷菌液分別加入相應組中，恒溫孵育；對于上述步驟中不同生物被膜形成后，進行定量分析。本發明明確了銅綠假單胞菌密度感應系統對銅綠假單胞菌—煙曲霉菌混合生物被膜的形成具有顯著的抑制作用。

技術領域

本發明涉及一種抑制生物被膜的方法，具體涉及一種體外抑制銅綠假單胞菌—煙曲霉菌混合生物被膜的研究方法，屬于生物相關技術領域。

背景技術

銅綠假單胞菌及煙曲霉菌是自然界中較常見的細菌及真菌，且為較常見的條件致病菌。無論是慢阻肺繼發肺內感染還是支擴肺內常見定植菌，亦或是近年發病率顯注升高的肺結核合并細菌真菌感染，銅綠假單胞菌及煙曲霉菌均為培養所常見的菌類。細菌及真菌在人體內生長主要以形成生物被膜的方式存在，混合感染則可形成混合生物被膜使之發揮更強大的耐藥性。目前國內外對于混合生物被膜的研究報導較少，國內外文獻有關于銅綠假單胞菌及煙曲霉菌的研究僅限于銅綠假單胞菌對于煙曲霉菌的抑制作用的研究，而沒有深入到兩者所形成的混合生物被膜的研究領域，這就給了該項研究的很大空間。

密度感應系統是指細菌通過監測其群體的細胞密度，利用自身信號分子來調節特定的基因表達，以保證生物被膜中營養物質的運輸和廢物的排出，避免細菌過度生長而造成空間和營養物質缺乏。密度感應系統對于細菌的調節作用包括：生物膜形成，生物發光，獨立基因的調節，抗生素的產生等等。

利用銅綠假單胞菌的密度感應系統對銅綠假單胞菌-煙曲霉菌混合生物被膜的研究尚屬空白。

發明內容

本發明的目的是提供一種體外抑制銅綠假單胞菌—煙曲霉菌混合生物被膜的方法，以彌補現有技術的不足。

銅綠假單胞菌的密度感應系統主要包括：las、rhl、pqs三個系統，其中las系統活化大量調節因子如rhlR.rhlI的轉錄，因而其在銅綠毒力決定因素的調節中占重要地位。其中las由lasR、lasI基因組成，rhl由rhlR、rhlI基因組成。

為達到上述目的，本發明采取的具體技術方案為：

一種密度感應系統對銅綠假單胞菌—煙曲霉菌混合生物被膜抑制作用的研究方法，包括以下步驟：

(1)煙曲霉孢子懸液的制備；

(2)銅綠假單胞菌野生菌株及其缺陷菌株菌液的制備：挑取銅綠假單胞菌野生菌株單菌落及銅綠假單胞菌密度感應缺陷菌株單菌落，分別接種于RPMI-1640培養基中，再稀釋；

(3)體外靜止兩種混合生物被膜模型的建立實驗分為6組，依次是煙曲霉菌-野生型銅綠假單胞菌組(A·f+PAO1)，煙曲霉菌-銅綠假單胞菌密度感應缺陷菌組(A.f+P.alasI/rhlI)，煙曲霉菌組(A.f)，野生型銅綠假單胞菌組(PAO1)，銅綠假單胞菌密度感應缺陷菌組(P.a lasI/rhlI)，RPMI-1640培養基作為空白對照組，每組接種于細胞培養板，其中每孔已事先各放置圓形玻璃細胞爬片，再將野生型銅綠假單胞菌液及銅綠假單胞菌密度感應缺陷菌液分別加入相應組中，恒溫孵育；

(4)對于上述步驟(3)中不同生物被膜形成后，進行定量分析。

進一步的，所述步驟(1)具體為：受試煙曲霉菌株接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基，收集孢子，配置RPMI-1640培養基；將收集到的孢子液加入到該RPMI-1640培養基內，用血細胞計數板調節孢子濃度，作為建立體外混合生物被膜模型的孢子懸液。