[發明專利]一種從人羊膜中制取干細胞的方法

在審

• 申請號: 201711386121.4
• 申請日: 2017-12-20
• 公開（公告）號: CN108103008A
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發明（設計）人: 曹毓琳;劉俊江;時兆田;白志惠;王沾
• 申請（專利權）人: 北京臻惠康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12N5/0775
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 王玉松

本發明涉及一種從人羊膜中制取干細胞的方法，所述方法包括：采集胎盤、取人羊膜、分離人羊膜上皮細胞、分離人羊膜間充質干細胞、細胞培養和凍存。本發明制備的人羊膜上皮細胞和人羊膜間充質干細胞純度高，培養后增殖快，為操作人員節省了大量時間，同時增加了每個人羊膜的利用率。

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，特別涉及一種從人羊膜中制取干細胞的方法。

背景技術

羊膜是胎盤的最內層，與人眼結膜組織結構相似，無血管、神經及淋巴，具有一定的彈性，厚約0.02-0.5mm，在電鏡下分為五層，分別是：上皮層、基底膜、致密層、纖維母細胞層和海綿層，人羊膜中的干細胞主要包含人羊膜間充質干細胞和人羊膜上皮細胞。

研究發現，人羊膜間充質干細胞具有與骨髓間充質干細胞相似的表型，增殖能力比骨髓間充質干細胞更強，同時，人羊膜無免疫原性，不會產生免疫排斥反應，因此，更適合用于細胞培養，而羊膜屬于分娩后的廢棄物，不涉及醫學倫理和法律問題，是組織工程和細胞治療的理想種子細胞，目前，原代人羊膜間充質干細胞和人羊膜上皮細胞的提取方法主要是酶解法，利用相應的酶對人羊膜進行消化，再進行接種培養，該方法分離人羊膜時，往往將人羊膜間充質干細胞和人羊膜上皮細胞一同分離下來，導致人羊膜上皮細胞與人羊膜間充質干細胞混雜在一起，不易分開，很難獲得純凈的細胞系，影響接下來的細胞培養和應用過程，現有技術使用細胞刮刀將混合細胞中的上皮細胞分離出來，但該方法存在增加污染率和分離不徹底的問題，現有技術中通過不同的酶解法從不同的人羊膜上分離原代人羊膜間充質干細胞或人羊膜上皮細胞，該方法限制了每個人羊膜只能分離得到一種細胞，造成資源浪費。

發明內容

針對以上人羊膜細胞的分離過程中存在的大量問題，本發明提供了一種從人羊膜中制取干細胞的方法，該方法分離培養的人羊膜間充質干細胞和人羊膜上皮細胞純度高，同時培養后的人羊膜間充質干細胞和人羊膜上皮細胞增殖快，為操作人員節省了大量時間。

本發明具體技術方案如下：

一種從人羊膜間充質干細胞分離培養方法，該方法包括以下步驟：

1)采集胎盤：取新鮮采集的胎盤，去除殘留的絨毛膜，置于體積比為5:1的0.9％的氯化鈉注射液和25％的乙醇溶液的混合溶液中清洗2min，再放置于PBS溶液中清洗1min，取出待用；

2)取人羊膜：將步驟1)所得的胎盤放置于圓盤中，用0.9％的氯化鈉注射液浸泡5min，取出，完整的撕取整個人羊膜，清洗干凈；

3)分離人羊膜上皮細胞：將步驟2)所得的人羊膜裁剪成100mm2的塊狀，將裁剪后的人羊膜上皮面朝上貼敷于無菌硝酸纖維膜上，向貼敷于無菌硝酸纖維膜上的人羊膜噴灑5-15mL細胞分離液將人羊膜全部浸潤，20min后，將人羊膜放置于第一培養皿中，加入15-30mL體積比為2:1的質量濃度為1mg/mL的Ⅱ型膠原酶和質量濃度為1mg/mL的DNA酶的混合溶液預消化20min，再在第一培養皿中加入3.5mg/mL的pH為7.5的胰蛋白酶，放置于30-45℃搖床中消化6.5min，消化結束后，向第一培養皿中加入20-40mL 8％FBS培養基終止消化，得細胞培養液，再將人羊膜放置于30mL生理鹽水中洗滌5次，每次5min，收集洗滌液和培養液，過300μm細胞篩網，離心，棄上清，收集下層的人羊膜上皮細胞；其中，所述細胞分離液包括重量份數為4-6的60％的泛影葡胺、重量份數為8-10的青霉素和重量份數為40-50的TritonX-100；

4)分離人羊膜間充質干細胞：將步驟3)分離人羊膜上皮細胞后的人羊膜放置于第二培養皿中，加入質量濃度為0.14％的胰蛋白酶進行消化，消化后的羊膜組織用PBS緩沖液沖洗，再加入質量濃度為0.5％的Ⅳ型膠原酶消化至羊膜組織溶化，加入PBS緩沖液稀釋，離心，得組織勻漿，離心，棄上清，收集下層的人羊膜間充質干細胞；