[發明專利]一種從人羊膜中制取干細胞的方法

在審

• 申請號: 201711386121.4
• 申請日: 2017-12-20
• 公開（公告）號: CN108103008A
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發明（設計）人: 曹毓琳;劉俊江;時兆田;白志惠;王沾
• 申請（專利權）人: 北京臻惠康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12N5/0775
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 王玉松

1.一種從人羊膜中制取干細胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

1)采集胎盤：取新鮮采集的胎盤，去除殘留的絨毛膜，置于體積比為5:1的0.9％的氯化鈉注射液和25％的乙醇溶液的混合溶液中清洗2min，再放置于PBS溶液中清洗1min，取出待用；

2)取人羊膜：將步驟1)所得的胎盤放置于圓盤中，用0.9％的氯化鈉注射液浸泡5min，取出，完整的撕取整個人羊膜，清洗干凈；

3)分離人羊膜上皮細胞：將步驟2)所得的人羊膜裁剪成100mm2的塊狀，將裁剪后的人羊膜上皮面朝上貼敷于無菌硝酸纖維膜上，向貼敷于無菌硝酸纖維膜上的人羊膜噴灑5-15mL細胞分離液將人羊膜全部浸潤，20min后，將人羊膜放置于第一培養皿中，加入15-30mL體積比為2:1的質量濃度為1mg/mL的Ⅱ型膠原酶和質量濃度為1mg/mL的DNA酶的混合溶液預消化20min，再在第一培養皿中加入3.5mg/mL的pH為7.5的胰蛋白酶，放置于30-45℃搖床中消化6.5min，消化結束后，向第一培養皿中加入20-40mL 8％FBS培養基終止消化，得細胞培養液，再將人羊膜放置于30mL生理鹽水中洗滌5次，每次5min，收集洗滌液和培養液，過300μm細胞篩網，離心，棄上清，收集下層的人羊膜上皮細胞；其中，所述細胞分離液包括重量份數為4-6的60％的泛影葡胺、重量份數為8-10的青霉素和重量份數為40-50的TritonX-100；

4)分離人羊膜間充質干細胞：將步驟3)分離人羊膜上皮細胞后的人羊膜放置于第二培養皿中，加入質量濃度為0.14％的胰蛋白酶進行消化，消化后的羊膜組織用PBS緩沖液沖洗，再加入質量濃度為0.5％的Ⅳ型膠原酶消化至羊膜組織溶化，加入PBS緩沖液稀釋，離心，得組織勻漿，離心，棄上清，收集下層的人羊膜間充質干細胞；

5)細胞培養：分別將步驟3)和步驟4)所得的人羊膜上皮細胞和人羊膜間充質干細胞調整細胞密度為2×106，接種到培養瓶中進行細胞原代培養和傳代培養；

6)凍存：將步驟5)所得的培養后的細胞進行凍存，即得凍存人羊膜上皮細胞和凍存人羊膜間充質干細胞。

2.如權利要求1所述的從人羊膜中制取干細胞的方法，其特征在于，步驟5)中所述細胞原代培養的具體方法為：在培養瓶中加入原代培養基，放置于二氧化碳恒溫恒濕培養箱中，于38±0.5℃、二氧化碳體積分數為5±0.2％的條件下進行細胞培養，培養時間為一周，隔1-2天對原代培養基進行一次全量換液，待細胞長滿瓶底65％-75％時，加入1mg/mL的胰蛋白酶消化細胞，待細胞變圓，立即終止消化，分離，收獲原代干細胞。

3.如權利要求2所述的從人羊膜中制取干細胞的方法，其特征在于，步驟5)中所述細胞傳代培養的具體方法為：將獲得的原代干細胞重懸于傳代培養基中，放置于培養箱中，在38±0.5℃、二氧化碳體積分數為5±0.2％的條件下進行細胞傳代培養。

4.如權利要求2所述的從人羊膜中制取干細胞的方法，其特征在于，所述原代培養基以L-15培養基為基礎，還包含以下濃度組分：100-250ng/mL的NGF、300-550ng/mL的天冬酰胺和200-500ng/mL的氯化鈉。

5.如權利要求3所述的從人羊膜中制取干細胞的方法，其特征在于，所述傳代培養基以AIM-V培養基為基礎，還包括以下濃度組分：100-200ng/mL的6-芐氨基嘌呤、300-500ng/mL的白細胞介素Ⅱ和100-150ng/mL的蠶豆蛋白。

6.如權利要求1所述的從人羊膜中制取干細胞的方法，其特征在于，步驟6)中所述細胞凍存的具體方法為：收集細胞并加入凍存液，將其裝于凍存管中，放入程序降溫盒后置于-80℃冰箱中，3-5h后，再將凍存管凍于液氮中。

7.如權利要求1所述從人羊膜中制取干細胞的方法，所述離心速度為1000rpm。

8.如權利要求6所述的從人羊膜中制取干細胞的方法，其特征在于，所述凍存液包含以下濃度組分：5-15mL/L的knock-out血清、5-50mL/L的羥乙基淀粉和12-20mL/L右旋糖苷。