[發明專利]一種適用于植物轉座酶可接近性染色質分析的建庫方法

在審

• 申請號: 201711386040.4
• 申請日: 2017-12-20
• 公開（公告）號: CN108130323A
• 公開（公告）日: 2018-06-08
• 發明（設計）人: 童云廣;王華印;徐鷺芹;趙楠;胡淺淺
• 申請（專利權）人: 奧明（杭州）基因科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種適用于植物轉座酶可接近性染色質分析的建庫方法，首先對植物幼嫩組織進行前處理，酶解細胞壁后過濾，利用DAPI染色在流式細胞儀上分選收集細胞核，過濾細胞核，有效的降低了細胞壁及亞細胞器對實驗數據的干擾。進行Tn5轉座酶切反應與純化，qPCR確定建庫所需循環數，最后對得到的單個文庫進行等摩爾混合，采用優化過的兩輪磁珠比例分選得到高質量的上機文庫，為廣大科研人員研究植物幼嫩組織易接近轉座酶核染色質高通量測序提供重要的實驗方法參考。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，特別涉及一種適用于植物轉座酶可接近性染色質分析的建庫方法。

背景技術

ATAC-seq是通過使用高通量測序對轉座酶可接近性核染色質區域進行分析(Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing)的一種創新表觀遺傳學研究技術。該技術通過轉座酶對某種特定時空下開放的核染色質區域進行切割，進而獲得在該特定時空下基因組中所有活躍轉錄的調控序列。

真核細胞將基因組DNA與組蛋白通過不同層次的折疊組裝成染色質，這些精密組裝信息在基因轉錄調控中起決定性作用。染色質區域的可接近性是特異性反式作用因子和順式調控元件相互作用的前提，基因表達的異常或者染色質調控因子的改變都將對細胞的命運產生深遠的影響，進而導致各種疾病的發生與發展。目前該技術已被廣泛應用于轉錄調控序列的鑒定。ATAC-seq技術可運用于所有真核細胞重編程的研究，在醫學領域是重大疾病發病機制、藥物作用機制、新藥研發和生物標志物功能等研究的新一代有利工具。

染色質結構在促進基因表達控制方面起著關鍵作用。轉錄因子結合的順式元件通常與染色質區域的可接近性相關。因此，在植物基因組中識別這些可接近性區域，將有利于提高對轉錄因子結合、染色質狀態和基因表達調控三者之間關系的理解。ATAC-seq現在通常被用于系統地鑒定動物基因組中的順式調控區域和DNA足跡，然而，這種方法對植物物種的應用是一個挑戰。在植物中，細胞壁和細胞器的存在、穩定細胞系的缺乏阻止了該技術在植物中的應用。植物染色質提取物中常含有線粒體和葉綠體等細胞器基因組，由于細胞器基因組也可以被Tn5轉座酶接近并切割，因此降低了用于酶切植物基因組的Tn5轉座酶活性。

發明內容

本發明的目的在于提供一種適用于植物轉座酶可接近性染色質分析的建庫方法，降低了植物葉片細胞壁及亞細胞器中基因組帶來的實驗干擾，采用優化過的實驗條件，通過兩輪磁珠分選，保留最佳上機測序文庫大小，從而得到高質量上機數據，為植物葉片易接近轉座酶核染色質的研究提供重要的實驗方法參考。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種適用于植物轉座酶可接近性染色質分析的建庫方法，包括以下步驟：

S1：植物組織(幼嫩組織)樣本經酶解液TS2和裂解液TS1處理后，得到細胞核懸浮液A；

S2：對細胞核懸浮液A中的細胞核進行染色(DAPI染色)、分選，得到細胞核B；

S3：對細胞核B進行轉座反應與純化，得到轉座產物C；

S4：對轉座產物C進行PCR擴增，得到擴增產物D；轉座產物C的取樣量為1～100ng，優選取樣量為40～60ng；

S5：取部分擴增產物D進行qPCR以確定額外所需PCR循環數，根據確定的額外所需PCR循環數對剩余擴增產物D繼續擴增，得到擴增產物E；

S6：純化擴增產物E得到單一文庫，單一文庫進行片段分選，得到上機文庫。