[發明專利]一種適用于植物轉座酶可接近性染色質分析的建庫方法

在審

• 申請號: 201711386040.4
• 申請日: 2017-12-20
• 公開（公告）號: CN108130323A
• 公開（公告）日: 2018-06-08
• 發明（設計）人: 童云廣;王華印;徐鷺芹;趙楠;胡淺淺
• 申請（專利權）人: 奧明（杭州）基因科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種適用于植物轉座酶可接近性染色質分析的建庫方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：植物組織樣本經酶解液TS2和裂解液TS1處理后，得到細胞核懸浮液A；

S2：對細胞核懸浮液A中的細胞核進行染色、分選，得到細胞核B；

S3：對細胞核B進行轉座反應與純化，得到轉座產物C；

S4：對轉座產物C進行PCR擴增，得到擴增產物D；

S5：取部分擴增產物D進行qPCR以確定額外所需PCR循環數，根據確定的額外所需PCR循環數對剩余擴增產物D繼續擴增，得到擴增產物E；

S6：純化擴增產物E得到單一文庫，單一文庫進行片段分選，得到上機文庫。

2.根據權利要求1所述的建庫方法，其特征在于，S1具體步驟如下：取200～300mg植物組織，用刀片在放置于冰上的培養皿中將組織切碎成勻漿狀，加入2.5～3.0mL酶解液TS2酶解4h去除細胞壁；4℃、300～400rpm離心10min后棄上清；加入2.5～3.0mL預冷的裂解液TS1，轉入離心管中并置于混勻器上100～150rpm振蕩5min，得到完全裂解后的混合液；將混合液過濾兩次，所得濾液分布于不同密度的分層液中，1000～1300rpm離心20～25min，收集分離的細胞核，加入600μL裂解液TS1，得到細胞核懸浮液A。

3.根據權利要求1所述的建庫方法，其特征在于，S2具體步驟如下：將細胞核懸浮液A使用40μm無菌過濾器過濾，收集濾液進行細胞核染色并根據細胞核大小進行分選，分選的細胞核使用預先裝入600μL裂解液TS1的離心管進行收集；顯微鏡下觀察分選得到的細胞核質量后，將收集到的細胞核4℃、1000～1300rpm離心15min，棄上清，加入600μL洗滌緩沖液洗滌細胞核，1000～1300rpm離心10min后棄上清得到細胞核B。

4.根據權利要求1所述的建庫方法，其特征在于，所述洗滌緩沖液組分構成如下：10mM、pH8.0的Tris-HCl，5mM MgCl₂。

5.根據權利要求1所述的建庫方法，其特征在于，S3具體步驟如下：取細胞核B立即進行轉座反應，細胞核B加入Tn5轉座酶后，37℃水浴反應30～70min；對水浴后的轉座產物進行純化，得到轉座產物C。

6.根據權利要求1或2所述的建庫方法，其特征在于，所述酶解液TS2組分構成如下：0.5％～1.5％纖維素酶，0.3％～0.6％果膠酶，0.3％～0.6％半纖維素酶，0.45～0.55M甘露醇，20mM KCl，10mM、pH5.7的2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物，10mM CaCl₂，0.1％牛血清白蛋白。

7.根據權利要求1或2或3所述的建庫方法，其特征在于，所述裂解液TS1組分構成如下：20mM Tris-HCl pH 8.0，75mM KCl，15mM NaCl，0.5mM精胺，10mMβ-巰基乙醇，2％PVP，0.3％TritonX-100。

8.根據權利要求1所述的建庫方法，其特征在于，S5中確定額外所需PCR循環數，其計算方式如下：根據熒光定量PCR曲線圖，取最大熒光值1/4時對應的循環數為額外所需的循環數。

9.根據權利要求1所述的建庫方法，其特征在于，S6具體步驟如下：將擴增產物E分別純化后，得到單一文庫，測定單一文庫的濃度，根據濃度將多個單一文庫等摩爾濃度混合成混合文庫，混合文庫使用兩輪DNA磁珠進行片段分選，保留200～1000bp的DNA片段得到分選后文庫，使用核酸分析儀器進行文庫質量檢測，檢測合格后得到上機文庫。

10.根據權利要求9所述的建庫方法，其特征在于，混合文庫使用兩輪DNA磁珠進行片段分選，第一輪磁珠的體積比例為0.4×～0.9×，第二輪磁珠的體積比例為0.5×～1.0×。