[發明專利]一種用于檢測牛輪狀病毒的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201711382428.7
• 申請日: 2017-12-15
• 公開（公告）號: CN108169492B
• 公開（公告）日: 2019-12-17
• 發明（設計）人: 喬薪瑗;王麗;李一經;唐麗杰;徐義剛;崔文;姜艷平
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 11139 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

本發明公開了一種用于檢測牛輪狀病毒的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法和應用。所述的試紙條包括從左到右依次連接的樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸水濾紙，還包括位于下方的PVC底板，其中PVC底板的作用是提供組裝平臺，硝酸纖維素膜上具有山羊抗鼠IgG噴涂的質控線，以及兔抗牛輪狀病毒多克隆抗體噴涂的檢測線，膠體金墊上涂覆有膠體金顆粒標記的鼠抗牛輪狀病毒VP6蛋白的單克隆抗體，樣品墊提供了待測樣品加入的位置；其中，所述的鼠抗牛輪狀病毒VP6蛋白的單克隆抗體是由保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會微生物中心的，菌種保藏編號為CGMCC NO.14726的雜交瘤細胞株分泌產生。本發明制備的試紙條，靈敏度好，特異性高，操作簡單、快速，適用于現地檢測。

技術領域

本發明涉及一種檢測牛輪狀病毒的試紙條，特別涉及一種基于膠體金技術制備的用于檢測牛輪狀病毒的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法和應用，本發明屬于醫藥技術領域。

背景技術

牛輪狀病毒(Bovine Rotaviens,BRV)，屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，是引起犢牛腹瀉的主要病原之一。牛輪狀病毒主要感染15-45日齡犢牛，發病早期表現為精神沉郁、流涎、腹瀉，若不及時治療，病牛可發生脫水、體溫下降，極易繼發細菌感染，并導致死亡。給我國養牛業帶來嚴重危害和巨大的經濟損失。因此，研究與開發牛輪狀病毒檢測的新技術，建立敏感性強、特異性高的快速檢測方法對診斷和防控牛輪狀病毒病，提高我國畜牧業的整體發展水平，推動畜牧業的健康發展具有重要的實踐意義。

目前，我國對牛輪狀病毒病的經典檢測方法是電鏡技術、分離培養、免疫熒光技術、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、核酸電泳法、反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)等。電鏡技術要求樣品中RV達到一定數量才能檢測到，并且要求具備特殊設備和專業技術人才，基層單位普及困難，應用受到限制。體外分離培養RV難度大、周期長，多數RV需要經過胰蛋白酶及胰凝乳酶等蛋白水解酶處理后才能適應細胞生長。因此，該方法局限性較大，且不利于大規模檢測。免疫熒光技術、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、核酸電泳法、反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)等方法檢測病原，對儀器和設備的要求較高，只適用于實驗室檢測，不適于現地檢測。

免疫膠體金技術的應用，最早出現在1980年，用膠體金檢測人絨毛膜促性腺激素(hCG)，1985便實現了商品化。膠體金技術是一種新型的免疫標記物，在各研究領域都得到了廣泛應用。比如食品安全方面，檢測瘦肉粉，蛋白粉，食用色素，抗生素等含量。在臨床上檢測病毒感染、細菌感染，為臨床診斷提供了更便捷的技術。隨著膠體金標記技術的發展，延伸至電鏡領域，形成了膠體金免疫電鏡技術，目前是最敏感的免疫組化方法。膠體金顆粒的優點在于，不染色可直接觀察，與其他物質區別大，分辨率高，用于定位結果準確。對組織細胞的吸附作用小，特異性好。薛擁志等用膠體金顆粒標記新城疫病毒后通過電鏡觀察，與直接電鏡觀察病毒結果比較，發現用膠體金免疫電鏡技術更容易找到病毒粒子，說明免疫金標記可以顯著提高病毒檢出率。膠體金探針主要用于電子顯微鏡的標記，當以不同的方式制備時，顆粒的密度與直徑有很大的選擇空間，使得它們適用于不同的試驗需要。在分子水平上，金顆粒直徑增大到30-100nm；在宏觀層面上，這將致在含有結合金顆粒的區域形成深色染色，大大增加了可見度和對比度。近年來將金標記應用于傳感器研究增多，Brainina等，Tang等，Kitano等都通過實驗驗證了標記特異性蛋白膠體金在生物傳感器上的作用，且敏感性與穩定性都有所提高。

本發明通過獲得BRV多克隆抗體和單克隆抗體腹水，結合膠體金免疫層析技術制備成膠體金免疫層析試紙條。膠體金免疫層析試紙條具有簡單快速、結果清晰的特點，無需復雜的操作技巧和特殊設備，且成本低、攜帶方便，因此，本發明的提出為BRV的快速診斷提供了一種敏感、特異的現地檢測方法，對BRV的綜合防控具有重要的實踐意義。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種簡單快速、適用于現地檢測牛輪狀病毒的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法和應用。

為了達到上述目的，本發明采用了以下技術手段：