[發明專利]一種用于檢測牛輪狀病毒的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201711382428.7
• 申請日: 2017-12-15
• 公開（公告）號: CN108169492B
• 公開（公告）日: 2019-12-17
• 發明（設計）人: 喬薪瑗;王麗;李一經;唐麗杰;徐義剛;崔文;姜艷平
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 11139 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

1.一種用于檢測牛輪狀病毒的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于所述的試紙條包括從左到右依次連接的樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸水濾紙，還包括位于下方的PVC底板，其中PVC底板的作用是提供組裝平臺，硝酸纖維素膜上具有山羊抗鼠IgG噴涂的質控線，以及兔抗牛輪狀病毒多克隆抗體噴涂的檢測線，膠體金墊上涂覆有膠體金顆粒標記的鼠抗牛輪狀病毒VP6蛋白的單克隆抗體，樣品墊提供了待測樣品加入的位置；

其中，所述的鼠抗牛輪狀病毒VP6蛋白的單克隆抗體是由保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會微生物中心的，菌種保藏編號為CGMCC NO.14726的雜交瘤細胞株分泌產生。

2.如權利要求1所述的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，用于牛輪狀病毒檢測時按照以下步驟進行：

(a)在點樣孔滴加測試樣品200μL，反應10-15min觀察結果；

(b)結果判定：

陽性結果：質控線和檢測線都出現紅色條帶；

陰性結果：僅在質控線出現現一條紅色條帶；

無效結果：若質控線無條帶出現，不論檢測線是否出現紅色條帶結果均判定為無效。

3.一種制備權利要求1所述的膠體金免疫層析試紙條的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(一)膠體金墊的制備

(1)玻璃器皿洗干凈，濃H₂SO₄中浸泡24h，沖洗10次洗凈殘留的濃H₂SO₄，再用洗滌劑刷洗玻璃器皿，自來水沖洗10次，去離子水反復清洗5次，超純水沖洗3-4次，烘箱干燥后，使用含5w/v％二甲基二氯硅烷的氯仿溶液硅化，然后用去離子水沖洗，干燥備用；

(2)將1g氯金酸加入硅化后的玻璃瓶中，再加入超純水定容至100mL，用0.45μm濾器過濾除菌；取1mL配制好的1w/v％的氯金酸溶液于步驟(1)硅化處理過的錐形瓶中，加超純水至100mL，稀釋后的氯金酸溶液置于水浴鍋中加熱煮沸2-3min，用玻璃棒劇烈攪拌溶液的同時加入1-2ml 37℃預熱的檸檬酸三鈉溶液，繼續煮沸5-8min后室溫冷卻，冷卻后加入超純水定容至100mL，用0.2mol/L的K₂CO₃溶液調節膠體金溶液pH至7.2-7.5，用0.22μm濾器過濾除菌，4℃避光保存，得到裸膠體金溶液；

(3)待標記抗體的準備

取出純化的鼠抗牛輪狀病毒VP6蛋白的單克隆抗體腹水，調整抗體濃度至1mg/mL，離心除去蛋白聚合物，調節待標記抗體溶液pH在8.5-9.0之間；

(4)取裸膠體金溶液離心，以除去溶液中形成的聚合物；調整裸膠體金溶液pH值在8.5-9.0之間，將待標記抗體溶液逐滴加入裸膠體金溶液中，加入時要邊攪拌邊加，1mg的抗體在4-6min內加完，然后室溫靜置；

(5)向步驟(4)得到的溶液中加入Tris-HC1緩沖液配制的10w/v％BSA溶液至其終濃度為1％作為穩定劑，以防止發生非特異性凝聚，室溫下繼續攪拌5min，室溫靜置15min；

(6)將步驟(5)得到的溶液1500r/min 4℃離心20min，棄掉底部聚合物雜質，用移液器輕輕吸取上清轉移到另一離心管中，再以4℃10000r/min離心20-30min，得到可流動的棕紅色高濃度的金標抗體；將得到的金標抗體產物用金標抗體復溶液稀釋5-10倍，得到金標抗體溶液，4℃避光保存備用；

所述的金標抗體復溶液為含1w/v％BSA、15w/v％蔗糖、0.5v/v％Tween-20的0.01mol/LpH為7.2的PB溶液，4℃保存備用；

(7)先將玻璃纖維素膜浸泡在含0.1v/v％Tween-20、5w/v％蔗糖、0.1w/v％PVA、1％w/vBSA的0.01mol/L PB溶液中10-20min，置于37℃烘箱中干燥12h，然后將金標抗體溶液均勻噴灑在玻璃纖維上，在室溫下烘干，得到膠體金墊；

(二)硝酸纖維素膜的制備

選擇pH7.2的0.01mol/L PB溶液稀釋純化的兔抗牛輪狀病毒多克隆抗體和山羊抗鼠IgG，劃線后在37℃烘干箱中，烘干1-2h；將劃好線的硝酸纖維素膜，浸于含有3w/v％BSA的0.01mol/L PB溶液中，37℃封閉1h后，用PBS緩沖液洗滌硝酸纖維素膜3次，每次5min，洗完膜后烘干；

(三)樣品墊的制備

室溫下，將樣品墊浸泡在樣品墊處理液中30min，然后放入37℃烘箱中烘干2-3h，用于組裝試紙條；所述的樣品墊處理液為含有0.05v/v％Tween-20、5w/v％蔗糖、0.5v/v％Triton X-100、0.5w/v％BSA的0.01mol/L PB溶液；

(四)試紙條的組裝

按照從左到右的依次為樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸水濾紙的順序，將制備好的樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸水濾紙組裝到PVC底板上，即得。