[發(fā)明專利]一種膠乳增強(qiáng)免疫比濁法定量檢測(cè)沙丁胺醇的試劑

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711380916.4
• 申請(qǐng)日: 2017-12-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108181248A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-06-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭蓬舉;劉昊旻;王威風(fēng);張倩茹;茍麗麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南聯(lián)博生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N21/31
• 分類號(hào): G01N21/31;G01N1/38
• 代理公司: 鄭州天陽(yáng)專利事務(wù)所(普通合伙) 41113
• 代理人: 聶永杰

1.一種膠乳增強(qiáng)免疫比濁法定量檢測(cè)沙丁胺醇的試劑，其特征是：本發(fā)明試劑包括試劑R1、試劑R2和標(biāo)準(zhǔn)品；

所述的試劑R1由甘氨酸 3.75-15.01g、沙丁胺醇-牛血清白蛋白復(fù)合物 0.2-1.1g，調(diào)PH至8.6，加蒸餾水定容至 1000ml制成，其中，沙丁胺醇-牛血清白蛋白復(fù)合物的制備方法是：沙丁胺醇150mg，加入4ml含22.8mg戊二酸酐的吡啶溶液中，室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)22h，攪拌速度150rpm；反應(yīng)后真空抽干反應(yīng)物中的吡啶；沉淀物溶解于8ml由二甲基甲酰胺（DMF）與1,4-二惡烷按體積比1:1配制成的溶劑中，加入正三丁胺52.4μl和氯甲酸異丁酯28.8μl，2-4℃下反應(yīng)1h，隨后將該反應(yīng)液逐滴加入10ml，4℃預(yù)冷的質(zhì)量濃度為0.2%的牛血清白蛋白溶液，4℃反應(yīng)48小時(shí)，反應(yīng)物在pH7.2磷酸緩沖鹽溶液（ PBS）中透析48小時(shí)，透析期間，每4小時(shí)換磷酸緩沖鹽溶液一次，除去未反應(yīng)的試劑，成沙丁胺醇-牛血清白蛋白復(fù)合物；

所述試劑R2由甘氨酸 3.75-15.01g、聚乙二醇6000 10-30 g、抗沙丁胺醇單抗交聯(lián)膠乳 100-600mg、牛血清白蛋白（BSA）10-30 g、Proclin300 1-5 ml，調(diào)PH至8.6，加蒸餾水定容至 1000ml制成，其中，抗沙丁胺醇單抗交聯(lián)膠乳的制備方法是：(l)活化羧基：稱取羧基膠乳顆粒20-200mg，膠乳顆粒直徑50-500nm，溶于pH6.5,50mM 10ml 的2-嗎啉乙磺酸（MES）中，得膠乳溶液，再將1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（EDC） 20mg、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS） 20mg依次加入上述膠乳溶液中，震蕩反應(yīng)1h成活化膠乳，隨后22000rpm下離心40分鐘，棄去上清液，沉淀使用pH6.5、濃度為50mM的2-嗎啉乙磺酸（MES）10ml復(fù)溶，重復(fù)離心二次，棄去上清液；沉淀溶于10ml 0.01M 的pH7.2磷酸緩沖鹽溶液（ PBS）中，成活化膠乳；(2)活化膠乳每毫升中加入400μg抗沙丁胺醇單克隆抗體，室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)4小時(shí)，成反應(yīng)液，反應(yīng)液每毫升中加入10%牛血清白蛋白（BSA）溶液500μl，繼續(xù)室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)；20000rpm下離心40分鐘，棄去上清液，沉淀用0.05M ，pH 8.6 的甘氨酸緩沖液復(fù)溶成抗沙丁胺醇抗體羧基膠乳交聯(lián)的羧基膠乳溶液；

標(biāo)準(zhǔn)品制備方法：（1）pH 7.4 0.01M磷酸緩沖鹽溶液（ PBS）的配制：將磷酸氫二鈉1.44g，磷酸二氫鉀 0.24g，氯化鈉8 g，氯化鉀0.2g用蒸餾水溶解、混勻，定容至1000ml，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)pH值至7.4，備用；（2）標(biāo)準(zhǔn)品的配制：將質(zhì)量純度99.5%的沙丁胺醇（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所對(duì)照品）1mg，用pH7.4 ，0.01M磷酸緩沖鹽溶液（ PBS）完全溶解，定容至濃度100μg/ml；取10μL ，100μg/ml沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品，用pH7.4， 0.01M磷酸緩沖鹽溶液（ PBS）定容至濃度100ng/ml；取4mL濃度為 100ng/ml的沙丁胺醇溶液，用pH7.4， 0.01M磷酸緩沖鹽溶液（ PBS）定容至濃度4.0ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠乳增強(qiáng)免疫比濁法定量檢測(cè)沙丁胺醇的試劑，其特征是：所述的試劑R1由甘氨酸 3.75g、沙丁胺醇-牛血清白蛋白復(fù)合物 0.2g，調(diào)PH至8.6，加蒸餾水定容至 1000ml制成，所述試劑R2由甘氨酸 3.75g、聚乙二醇6000 10 g、抗沙丁胺醇單抗交聯(lián)膠乳 100mg、牛血請(qǐng)白蛋白（BSA）10 g、Proclin300 1 ml，調(diào)PH至8.6，加蒸餾水定容至1000ml制成。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠乳增強(qiáng)免疫比濁法定量檢測(cè)沙丁胺醇的試劑，其特征是：所述試劑R1由甘氨酸 7.505g、沙丁胺醇-牛血清白蛋白復(fù)合物 0.4g，調(diào)PH至8.6，加蒸餾水定容至1000ml制成；

所述試劑R2由 甘氨酸 7.505g、聚乙二醇6000 20g、抗沙丁胺醇單抗交聯(lián)膠乳300mg、牛血請(qǐng)白蛋白（BSA）20g、Proclin300 2ml，調(diào)PH至8.6，加蒸餾水定容至1000ml制成。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠乳增強(qiáng)免疫比濁法定量檢測(cè)沙丁胺醇的試劑，其特征是：所述試劑R1由甘氨酸 15.01g、沙丁胺醇-牛血清白蛋白復(fù)合物 1.1g，調(diào)PH至8.6，加蒸餾水定容至1000ml制成；

所述試劑R2:由甘氨酸 15.01g、聚乙二醇6000 30g、抗沙丁胺醇單抗交聯(lián)膠乳 600mg、牛血請(qǐng)白蛋白（BSA）30g、Proclin300 5ml，調(diào)PH至8.6，加蒸餾水定容至1000ml制成。