[發明專利]一種膠乳增強免疫比濁法定量檢測黃曲霉毒素B1的試劑

在審

• 申請號: 201711380795.3
• 申請日: 2017-12-20
• 公開（公告）號: CN108181247A
• 公開（公告）日: 2018-06-19
• 發明（設計）人: 鄭蓬舉;劉昊旻;王威風;張倩茹;茍麗麗
• 申請（專利權）人: 河南聯博生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N1/38
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙) 41113
• 代理人: 聶永杰

1.一種膠乳增強免疫比濁法定量檢測黃曲霉毒素B1的試劑，其特征是：包括試劑R1、試劑R2和標準品；所述試劑R1由三羥甲基氨基甲烷（Tris）1.21-24.23 g、黃曲霉毒素B1-載體蛋白復合物 0.15-1.2 g，用HCL調pH至7.4，加蒸餾水定容至1000ml制成；其中，黃曲霉毒素B1-載體蛋白復合物的制備方法是：黃曲霉毒素B1 10mg溶于2ml甲醇，加入50μL 質量濃度為10%的H₂SO₄，混合物在56℃下攪拌反應4h；反應產物真空抽干，加入5ml蒸餾水，用25ml氯仿分兩次提取，然后用30ml蒸餾水洗滌有機層；真空抽干去除有機溶劑，得黃色固體物；取1.0mg黃色固體物，加入4ml ，質量濃度為0.5%牛血清白蛋白（BSA）溶液（4mL 0.01M pH7.2磷酸鹽緩沖液溶解20mg BSA），37℃反應30min；加入150μL 6.5mmol/L NaHB₄ ，4℃反應30min；加入100μL 濃度為0.1M的 HCl，除去過量的NaHB₄；4℃反應48小時，反應完成后，置于濃度0.01M ,pH7.2 磷酸鹽緩沖液(PBS)中透析48小時，每4h換PBS溶液一次，除去未反應的固體物，即為黃曲霉毒素B1-牛血清白蛋白復合物；

所述的試劑R2由三羥甲基氨基甲烷（Tris）1.21-24.23 g，聚乙二醇6000 10-30 g，抗黃曲霉毒素B1單抗交聯膠乳80-500mg，牛血清白蛋白（BSA）10-30 g，Proclin300 1-5ml混勻，用HCL調PH至7.4，加蒸餾水定容至1000ml制成；其中，抗黃曲霉毒素B1單抗交聯膠乳的制備方法是：(l)活化羧基：稱取羧基膠乳顆粒30-200mg，膠乳顆粒直徑50-500nm，溶于pH6.5,50mM 10ml 2-嗎啉乙磺酸（MES）中，成乳膠溶液；稱取交聯劑1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）30mg、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）30mg依次加入上述膠乳溶液中，震蕩活化反應1h，成活化膠乳顆粒，在22000rpm下離心40分鐘，棄去上清液，沉淀用pH6.5,濃度50mM的 2-嗎啉乙磺酸（MES）10ml復溶，重復離心二次；沉淀溶于10ml 0.01M pH7.2 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中，成活化膠乳；(2)活化膠乳每毫升中加入500μg黃曲霉毒素B1單克隆抗體，室溫攪拌下反應4小時，得反應液，隨后每毫升反應液加入質量濃度為10%的牛血清白蛋白（BSA）溶液500μl，繼續室溫攪拌反應2小時 ；20000rpm下離心40分鐘；去上清液，沉淀用0.01M ,pH7.4 Tris-HCL緩沖液復溶，即成抗黃曲霉毒素B1單抗交聯膠乳；

所述標準品制備方法：（1）pH 7.4 0.01M磷酸鹽緩沖溶液（PBS）的配制：分別稱取磷酸氫二鈉1.44g，磷酸二氫鉀 0.24g，氯化鈉8 g，氯化鉀0.2g，用蒸餾水溶解、混勻，定容至1000ml，調pH值至7.4，備用；（2）標準品的配制：將純度99.8%的黃曲霉毒素B1 1mg，用甲醇完全溶解后，定容至濃度100μg/ml；取10μL 濃度為100μg/ml黃曲霉毒素B1標準品，用0.01M,pH7.4磷酸鹽緩沖溶液（PBS）定容至濃度100ng/ml；取2.5mL 濃度100ng/ml黃曲霉毒素B1溶液，用pH7.4濃度為0.01M磷酸鹽緩沖溶液（PBS）定容至濃度為2.5ng/ml的標準品。

2.根據權利要求1所述的膠乳增強免疫比濁法定量檢測黃曲霉毒素B1的試劑，其特征是：所述試劑R1由碳酸鈉1.59 g、碳酸氫鈉2.94 g、黃曲霉毒素B1-載體蛋白復合物 0.15g，調PH至9.5，加蒸餾水定容至1000ml制成；所述的試劑R2由碳酸鈉1.59 g，碳酸氫鈉 2.94g，聚乙二醇6000 10 g，抗黃曲霉毒素B1單抗交聯膠乳80mg，牛血請白蛋白（BSA）10 g，Proclin300 1ml，調PH至9.5，加蒸餾水定容至1000ml制成。