[發明專利]測定生物樣品中丙酮酸乙酯及其代謝物丙酮酸的方法

有效

• 申請號: 201711378269.3
• 申請日: 2017-12-19
• 公開（公告）號: CN108169370B
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發明（設計）人: 郭繼芬;楊瑩;李照豐
• 申請（專利權）人: 萬舒（北京）醫藥科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.測定生物樣品中丙酮酸乙酯或其代謝產物丙酮酸含量的方法，該方法使用紫外檢測的高效液相色譜法，其簡稱為HPLC-UV法，以生物樣品中的丙酮酸含量為檢測指標，用從未給予丙酮酸乙酯的生物體獲得的生物樣品中內源性丙酮酸含量為本底，測定從給予丙酮酸乙酯的生物體獲得的生物樣品中代謝性丙酮酸含量，進而測定丙酮酸乙酯在生物體內的動力學；所述高效液相色譜法包括如下項目或步驟：

(1)色譜分析條件

色譜柱為C₁₈柱，并配合C₁₈保護柱使用；

流動相為0.025～0.075mol/L的KH₂PO₄緩沖液；

流速為0.8～1.2ml/min，等度洗脫；紫外檢測波長為205～220nm；

(2)代血漿的配制和測定

精密稱取牛血清白蛋白300mg，溶于生理鹽水10mL中，渦旋混勻，得到空白代血漿；

取空白代血漿50μL，置于1.5mL離心管中，依次加入超純水10μL和沉淀劑乙腈150μL，渦旋3min，離心，取上清液10μL進行HPLC-UV分析測定，以確定空白代血漿中無丙酮酸干擾；

(3)丙酮酸標準溶液的配制和測定

精密稱取丙酮酸對照品50.0mg于10mL容量瓶中，用超純水溶解、定容、搖勻，配制成濃度為5.0mg/mL的儲備液，4℃冰箱冷藏保存；精密量取一定體積的儲備液，用水稀釋成濃度為25、50、100、250、500、1000和2500μg/mL的系列標準溶液；

取空白代血漿50μL，置于1.5mL離心管中，加入丙酮酸系列標準溶液10μL，配制成相當于濃度為5、10、20、50、100、200、500μg/mL的代血漿樣品，加入沉淀劑乙腈150μL，渦旋3min，離心，取上清液10μL進行HPLC-UV分析測定，根據色譜響應值與丙酮酸加樣量確定標準曲線；

(4)未給予丙酮酸乙酯生物體的生物樣品中丙酮酸含量的測定

取未給予丙酮酸乙酯的生物體生物樣品血漿50μL，置于1.5mL離心管中，依次加入超純水10μL和乙腈沉淀劑150μL，渦旋3min，離心，取上清液10μL進行HPLC-UV分析測定，根據色譜響應值與標準曲線確定該生物樣品中內源性丙酮酸含量，作為丙酮酸的本底含量；

(5)給予丙酮酸乙酯生物體的生物樣品中丙酮酸含量的測定

取給予丙酮酸乙酯的生物體生物樣品血漿50μL，置于1.5mL離心管中，依次加入超純水10μL和乙腈沉淀劑150μL，渦旋3min，離心，取上清液10μL進行HPLC-UV分析測定，根據色譜響應值與標準曲線確定該生物樣品中代謝性丙酮酸含量，作為給予丙酮酸乙酯后生物體生物樣品中丙酮酸的含量；

(6)根據步驟(4)和步驟(5)的結果確定生物樣品中因生物體給予丙酮酸乙酯所貢獻的丙酮酸含量，另外根據生物樣品取樣時間確定丙酮酸乙酯在生物體內的動力學，

其特征在于，隨沉淀劑乙腈一起還添加氯化鈣0.2mg和丙二醇10μl，氯化鈣和丙二醇是溶解在一起形成鹽醇溶液后與所述乙腈一起添加的。

2.根據權利要求1的方法，其中所述的色譜柱是柱長20～30mm、內徑4.6mm、填料粒度5μm的色譜柱。

3.根據權利要求1的方法，其中所述的流動相KH₂PO₄緩沖液中包含0.6～0.8％的H₃PO₄。

4.根據權利要求1的方法，其中所述生物體選自：人、大鼠、小鼠、犬、猴。

5.根據權利要求1的方法，其中離心是以12000rpm離心10min。

6.根據權利要求1的方法，其中流速為1ml/min。

7.根據權利要求1的方法，其中紫外檢測波長為210nm。