[發(fā)明專利]一種脾氨肽內(nèi)多肽的提取方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711377944.0
• 申請(qǐng)日: 2017-12-19
• 公開（公告）號(hào): CN108129549B
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李起豎;李一釗;盧進(jìn)軍;盧麗琴;金潔
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江豐安生物制藥有限公司
• 主分類號(hào): C07K1/36
• 分類號(hào): C07K1/36;C07K1/16;C07K1/34;C07K1/14
• 代理公司: 北京維正專利代理有限公司 11508
• 代理人: 邢永

本發(fā)明公開了脾氨肽內(nèi)多肽的提取方法，包括以下步驟，步驟一，試劑配制，配制流動(dòng)相A、流動(dòng)相B；步驟二，樣品處理，將脾氨肽加入到起始流動(dòng)相中，得到樣品溶液；步驟三，分離純化。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：采用色譜分離技術(shù)，色譜柱吸附脾氨肽內(nèi)的多肽、糖、游離氨基酸、核苷酸等物質(zhì)，梯度洗脫過程中，將多肽從色譜柱上集中洗脫出來；在色譜分離過程中，選用合適的流動(dòng)相以及色譜柱，能將脾氨肽內(nèi)的多肽集中洗脫，多個(gè)色譜峰之間間隔較大，達(dá)到了分離純化脾氨肽內(nèi)多肽、分離效果好、操作簡單的效果。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物制品領(lǐng)域，特別涉及一種脾氨肽內(nèi)多肽的提取方法。

背景技術(shù)

脾氨肽口服凍干粉屬于從臟器提取的生化藥，主要成分包括氨基酸、多肽、核苷酸等物質(zhì)，作為免疫體調(diào)節(jié)劑，用于反復(fù)呼吸道感染、支氣管炎、哮喘、肺炎、癌癥等病癥的輔助治療。臨床觀察顯示，能夠有效提高患者的抵抗力，減少呼吸道感染的發(fā)生率，并具有調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫的功能，脾氨肽中主要的活性物質(zhì)為多肽，國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-(X-002)-2002Z中，測(cè)定多肽的含量是控制脾氨肽產(chǎn)品含量的唯一指標(biāo)，將脾氨肽內(nèi)的多肽分離純化后，對(duì)于研究脾氨肽作為免疫調(diào)節(jié)劑的作用機(jī)制，以及將分離的多肽作為凍干粉制劑以顯著提高藥品的活力，都具有顯著的作用和意義，因此，有必要提出一種脾氨肽內(nèi)多肽的提取方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種脾氨肽內(nèi)多肽的提取方法，具有分離脾氨肽內(nèi)多肽的效果。

本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：一種脾氨肽內(nèi)多肽的提取方法，包括以下步驟步驟一，試劑配制，配制流動(dòng)相A、流動(dòng)相B，流動(dòng)相A內(nèi)溶劑為水、溶質(zhì)為質(zhì)量百分比濃度為0.1％的甲酸，流動(dòng)相B內(nèi)溶劑為乙腈、溶質(zhì)包括質(zhì)量百分比濃度為0.1％的甲酸和質(zhì)量百分比濃度為0.1％的環(huán)己醚；步驟二，樣品處理，將脾氨肽加入到起始流動(dòng)相中，得到樣品溶液；步驟三，分離純化，色譜條件：色譜柱選用Agilent Poroshell300SB-C18,色譜柱內(nèi)填料顆粒為多孔硅膠，填料顆粒直徑為5μm，色譜柱內(nèi)徑為2.1mm，柱長為75mm，柱溫40℃，梯度洗脫0min-13min-13.5min-26min-35min,流動(dòng)相B5％-11.2％-15.8％-36％-60％；流速0.5ml/min，進(jìn)樣體積為20μL，檢測(cè)波長214nm，收集出峰時(shí)間為16.060-16.462min、23.072-24.022min、29.968-31.451min的色譜峰，得到分離出來的多肽。

通過采用上述技術(shù)方案，色譜分離是一種分離復(fù)雜混合物中各種組分的有效方法，利用不同物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相構(gòu)成的體系中具有不同的分配系數(shù)，當(dāng)流動(dòng)相和固定相相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，這些物質(zhì)隨流動(dòng)相一起運(yùn)動(dòng)，并在兩相間進(jìn)行反復(fù)的分配，從而使各組分達(dá)到分離。

脾氨肽內(nèi)主要組分包括多肽、游離氨基酸、核苷酸、糖，本申請(qǐng)采用色譜分離技術(shù)從脾氨肽內(nèi)分離純化出多肽，色譜分離的條件中，選用硅膠柱作為色譜柱，流動(dòng)相A內(nèi)溶劑為水，溶質(zhì)為甲酸，流動(dòng)相B內(nèi)溶劑為乙腈，溶質(zhì)為甲酸和環(huán)己醚，采用梯度洗脫的方法，0-13min時(shí)，流動(dòng)相組分內(nèi)包括95％的流動(dòng)相A和5％的流動(dòng)相B，將脾氨肽內(nèi)的游離氨基酸、核苷酸從色譜柱上洗脫下來；13-13.5min，流動(dòng)相組分內(nèi)包括88.8％的流動(dòng)相A和11.2％的流動(dòng)相B，將脾氨肽內(nèi)的核苷酸和糖從色譜柱上洗脫下來。通過梯度洗脫的方式，陸續(xù)從各組分分離出來，由于脾氨肽內(nèi)成分復(fù)雜，色譜分離技術(shù)在分離純化脾氨肽內(nèi)的多肽時(shí)，很難將多肽與脾氨肽內(nèi)的其他組分如糖、核苷酸等物質(zhì)徹底分離。因此，本申請(qǐng)?jiān)诹鲃?dòng)相中加入環(huán)已醚，環(huán)已醚加入流動(dòng)相B中，在梯度洗脫過程中能明顯改善出峰趨勢(shì)，在步驟三的色譜條件下，使脾氨肽內(nèi)的多肽集中在出峰時(shí)間為16.060-16.462min、23.072-24.022min、29.968-31.451min的色譜峰，能夠?qū)⑵彪膬?nèi)的多肽從脾氨肽內(nèi)分離出來，達(dá)到了分離純化脾氨肽內(nèi)多肽的效果。

本發(fā)明的進(jìn)一步設(shè)置為：還包括步驟四，冷凍干燥，對(duì)步驟三得到的樣品冷凍干燥處理，得到凍干粉。