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[發(fā)明專利]檢測志賀氏氏菌環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增試驗引物組及其應(yīng)用在審

專利信息
申請?zhí)枺?/td> 201711377805.8 申請日: 2017-12-19
公開(公告)號: CN107904320A 公開(公告)日: 2018-04-13
發(fā)明(設(shè)計)人: 溫和心;龍英全;蔣榮華 申請(專利權(quán))人: 溫和心
主分類號: C12Q1/689 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/01
代理公司: 廣州市深研專利事務(wù)所44229 代理人: 陳雅平
地址: 537100 廣西壯*** 國省代碼: 廣西;45
權(quán)利要求書: 查看更多 說明書: 查看更多
摘要:
搜索關(guān)鍵詞: 檢測 志賀氏氏菌環(huán)介導(dǎo) 恒溫 擴(kuò)增 試驗 引物 及其 應(yīng)用
【說明書】:

技術(shù)領(lǐng)域

發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種恒溫環(huán)介導(dǎo)試驗檢測志賀氏菌的引物組。

背景技術(shù)

志賀氏菌(Shigella)是一種在世界范圍內(nèi)廣泛流行的人畜共患病的病原菌,主要引起人和動物急性腸炎。志賀氏菌是發(fā)達(dá)國家最常見的腹瀉病病原菌之一,是受到高度關(guān)注的人畜共患病病原,國際獸疫組織(OIE)規(guī)定實驗猴貿(mào)易必檢項目。我國志賀氏菌檢驗當(dāng)前采用的方法是傳統(tǒng)分離培養(yǎng)-生化鑒定法,志賀氏菌培養(yǎng)過程中大量雜菌會把目的菌落覆蓋,較難找出典型菌落,所以該方法檢出率低,工作強(qiáng)度大,檢出率低。隨著新技術(shù)的出現(xiàn),有必要開發(fā)出一套準(zhǔn)確快速的檢測方法,輔助或代替現(xiàn)行的志賀氏菌檢測方法,以適應(yīng)技術(shù)進(jìn)步新要求。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP) 技術(shù)優(yōu)點是一是設(shè)備簡單,只需要水浴鍋溫育即可,不需要復(fù)雜或貴重儀器。二是快速高效,核酸擴(kuò)增在l小時內(nèi)即可完成。三是特異性高,要求4 種特異性引物,引物不匹配不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增。四是高靈敏度,熒光PCR 的靈敏度相當(dāng),比PCR 高10~100倍。五是成本低廉,特別適合現(xiàn)場檢疫和基層單位如防疫站檢疫或養(yǎng)殖場檢疫。LAMP技術(shù)的核心要素是引物,引物的優(yōu)劣決定著各種形式LAMP試驗性能,LAMP引物共有內(nèi)引物對和外引物對4條,設(shè)計要求較高,要求引物組對靶DNA擴(kuò)增性能好,對志賀氏菌特異性反應(yīng),還要求4條引物之間或自身不能發(fā)生退火情況發(fā)生,否則容易產(chǎn)生假陽性。但擴(kuò)增效率高、特異性強(qiáng)、無假陽性LAMP引物的設(shè)計成功率不高,需要從大量的引物中去測試,最后選擇出符合要求的引物組。所以志賀氏菌LAMP引物組是經(jīng)過實踐檢驗的科研成果,對志賀氏菌檢驗有較高的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有LAMP技術(shù)引物設(shè)計中存在的引物通用性和特異性不足的缺陷,充分利用目前公共數(shù)據(jù)資源中豐富的微生物基因組序列信息以及相應(yīng)的序列分析工具,設(shè)計用于特異性識別志賀氏菌的引物組,并在此基礎(chǔ)上形成高靈敏度、高特異性檢測試劑盒。本發(fā)明基于GenBank數(shù)據(jù)庫中的微生物基因組數(shù)據(jù)資源(截至2013年8月5日數(shù)據(jù))進(jìn)行志賀氏菌LAMP引物的設(shè)計,提供了一種快速恒溫擴(kuò)增檢測志賀氏菌的方法、引物組及試劑盒。

本發(fā)明的一個目的在于提供2組引物,各含1對上下游內(nèi)引物和1對上下游外引物,引物DNA序列信息如下:

引物組A:

上游外引物F3_A:5’-GAAGAGCATGCCAACACCT-3’(SEQ ID NO:1);

下游外引物B3_A:5’-TCCTCACAGCTCTCAGTGG-3’(SEQ ID NO:2);

上游內(nèi)引物FIP_A:5’-CGGAATCCGGAGGTATTGCGT-TTTCCGCGTTCCTTGACC-3’(SEQ ID NO:3);

下游內(nèi)引物BIP_A:5’-CGCTGCATGGCTGGAAAAACTC-GCAGCAACAGCGAAAGACT-3’(SEQ ID NO:4);

引物組B:

上游外引物F3_B:5’-GGTCATTTGCTGTCACTCC-3’(SEQ ID NO:5);

下游外引物B3_B:5’-CTGGGCAGGGAAATGTTC-3’(SEQ ID NO:6);

上游內(nèi)引物FIP_B:

5’-GCTCGCAGAGAAACTTCAGCT-CGACACGCCATAGAAACG-3’(SEQ ID NO:7);

下游內(nèi)引物BIP_B:5’-TGGTCTGGAAGGCCAGGTAG-CATTGCCCGGGATAAAGTC-3’(SEQ ID NO:8)。

本發(fā)明的另一個目的在于,提供一種檢測志賀氏菌的試劑盒,包括能檢測志賀氏菌的基因組特異堿基序列的環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增試驗引物組,還包括Bst DNA聚合酶緩沖液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、MgSO4和Betaine;

本發(fā)明的另一個目的在于,提供了一種志賀氏菌的方法,包括以下步驟:

(1)提取待測菌的基因組DNA;

(2)以提取的基因組DNA為模板,使用本發(fā)明的引物組進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增;

(3)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測,通過判斷反應(yīng)結(jié)果是否為陽性,確定待測樣品中是否存在志賀氏菌;

其中,所述LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)程序為:

(1)90~98℃熱水浴0.5~3min;

(2)50℃水浴反應(yīng)0.5~3min;

(3)63℃水浴反應(yīng)0.5~2h;

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