[發明專利]檢測志賀氏氏菌環介導恒溫擴增試驗引物組及其應用在審

申請號：	201711377805.8	申請日：	2017-12-19
公開（公告）號：	CN107904320A	公開（公告）日：	2018-04-13
發明（設計）人：	溫和心;龍英全;蔣榮華	申請（專利權）人：	溫和心
主分類號：	C12Q1/689	分類號：	C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/01
代理公司：	廣州市深研專利事務所44229	代理人：	陳雅平
地址：	537100 廣西壯***	國省代碼：	廣西;45
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摘要：
搜索關鍵詞：	檢測志賀氏氏菌環介導恒溫擴增試驗引物及其應用
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種恒溫環介導試驗檢測志賀氏菌的引物組。

背景技術

志賀氏菌（Shigella）是一種在世界范圍內廣泛流行的人畜共患病的病原菌，主要引起人和動物急性腸炎。志賀氏菌是發達國家最常見的腹瀉病病原菌之一，是受到高度關注的人畜共患病病原，國際獸疫組織（OIE）規定實驗猴貿易必檢項目。我國志賀氏菌檢驗當前采用的方法是傳統分離培養-生化鑒定法，志賀氏菌培養過程中大量雜菌會把目的菌落覆蓋，較難找出典型菌落,所以該方法檢出率低，工作強度大，檢出率低。隨著新技術的出現，有必要開發出一套準確快速的檢測方法，輔助或代替現行的志賀氏菌檢測方法，以適應技術進步新要求。

環介導等溫擴增（LAMP）技術優點是一是設備簡單，只需要水浴鍋溫育即可，不需要復雜或貴重儀器。二是快速高效，核酸擴增在l小時內即可完成。三是特異性高，要求4 種特異性引物，引物不匹配不能進行核酸擴增。四是高靈敏度，熒光PCR 的靈敏度相當，比PCR 高10～100倍。五是成本低廉，特別適合現場檢疫和基層單位如防疫站檢疫或養殖場檢疫。LAMP技術的核心要素是引物，引物的優劣決定著各種形式LAMP試驗性能，LAMP引物共有內引物對和外引物對4條，設計要求較高，要求引物組對靶DNA擴增性能好，對志賀氏菌特異性反應，還要求4條引物之間或自身不能發生退火情況發生，否則容易產生假陽性。但擴增效率高、特異性強、無假陽性LAMP引物的設計成功率不高，需要從大量的引物中去測試，最后選擇出符合要求的引物組。所以志賀氏菌LAMP引物組是經過實踐檢驗的科研成果，對志賀氏菌檢驗有較高的應用價值。

發明內容

本發明要解決的技術問題在于克服現有LAMP技術引物設計中存在的引物通用性和特異性不足的缺陷，充分利用目前公共數據資源中豐富的微生物基因組序列信息以及相應的序列分析工具，設計用于特異性識別志賀氏菌的引物組，并在此基礎上形成高靈敏度、高特異性檢測試劑盒。本發明基于GenBank數據庫中的微生物基因組數據資源（截至2013年8月5日數據）進行志賀氏菌LAMP引物的設計，提供了一種快速恒溫擴增檢測志賀氏菌的方法、引物組及試劑盒。

本發明的一個目的在于提供2組引物，各含1對上下游內引物和1對上下游外引物，引物DNA序列信息如下：

引物組A：

上游外引物F3_A：5’-GAAGAGCATGCCAACACCT-3’(SEQ ID NO：1)；

下游外引物B3_A：5’-TCCTCACAGCTCTCAGTGG-3’(SEQ ID NO：2)；

上游內引物FIP_A：5’-CGGAATCCGGAGGTATTGCGT-TTTCCGCGTTCCTTGACC-3’(SEQ ID NO：3)；

下游內引物BIP_A：5’-CGCTGCATGGCTGGAAAAACTC-GCAGCAACAGCGAAAGACT-3’(SEQ ID NO：4)；

引物組B：

上游外引物F3_B：5’-GGTCATTTGCTGTCACTCC-3’(SEQ ID NO：5)；

下游外引物B3_B：5’-CTGGGCAGGGAAATGTTC-3’(SEQ ID NO：6)；

上游內引物FIP_B：

5’-GCTCGCAGAGAAACTTCAGCT-CGACACGCCATAGAAACG-3’(SEQ ID NO：7)；

下游內引物BIP_B：5’-TGGTCTGGAAGGCCAGGTAG-CATTGCCCGGGATAAAGTC-3’(SEQ ID NO：8)。