[發(fā)明專利]檢測志賀氏氏菌環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增試驗引物組及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711377805.8
• 申請日: 2017-12-19
• 公開（公告）號: CN107904320A
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 溫和心;龍英全;蔣榮華
• 申請（專利權(quán)）人: 溫和心
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 廣州市深研專利事務(wù)所44229
• 代理人: 陳雅平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種恒溫環(huán)介導(dǎo)試驗檢測志賀氏菌的引物組。

背景技術(shù)

志賀氏菌（Shigella）是一種在世界范圍內(nèi)廣泛流行的人畜共患病的病原菌，主要引起人和動物急性腸炎。志賀氏菌是發(fā)達國家最常見的腹瀉病病原菌之一，是受到高度關(guān)注的人畜共患病病原，國際獸疫組織（OIE）規(guī)定實驗猴貿(mào)易必檢項目。我國志賀氏菌檢驗當(dāng)前采用的方法是傳統(tǒng)分離培養(yǎng)-生化鑒定法，志賀氏菌培養(yǎng)過程中大量雜菌會把目的菌落覆蓋，較難找出典型菌落,所以該方法檢出率低，工作強度大，檢出率低。隨著新技術(shù)的出現(xiàn)，有必要開發(fā)出一套準(zhǔn)確快速的檢測方法，輔助或代替現(xiàn)行的志賀氏菌檢測方法，以適應(yīng)技術(shù)進步新要求。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP） 技術(shù)優(yōu)點是一是設(shè)備簡單，只需要水浴鍋溫育即可，不需要復(fù)雜或貴重儀器。二是快速高效，核酸擴增在l小時內(nèi)即可完成。三是特異性高，要求4 種特異性引物，引物不匹配不能進行核酸擴增。四是高靈敏度，熒光PCR 的靈敏度相當(dāng)，比PCR 高10～100倍。五是成本低廉，特別適合現(xiàn)場檢疫和基層單位如防疫站檢疫或養(yǎng)殖場檢疫。LAMP技術(shù)的核心要素是引物，引物的優(yōu)劣決定著各種形式LAMP試驗性能，LAMP引物共有內(nèi)引物對和外引物對4條，設(shè)計要求較高，要求引物組對靶DNA擴增性能好，對志賀氏菌特異性反應(yīng)，還要求4條引物之間或自身不能發(fā)生退火情況發(fā)生，否則容易產(chǎn)生假陽性。但擴增效率高、特異性強、無假陽性LAMP引物的設(shè)計成功率不高，需要從大量的引物中去測試，最后選擇出符合要求的引物組。所以志賀氏菌LAMP引物組是經(jīng)過實踐檢驗的科研成果，對志賀氏菌檢驗有較高的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有LAMP技術(shù)引物設(shè)計中存在的引物通用性和特異性不足的缺陷，充分利用目前公共數(shù)據(jù)資源中豐富的微生物基因組序列信息以及相應(yīng)的序列分析工具，設(shè)計用于特異性識別志賀氏菌的引物組，并在此基礎(chǔ)上形成高靈敏度、高特異性檢測試劑盒。本發(fā)明基于GenBank數(shù)據(jù)庫中的微生物基因組數(shù)據(jù)資源（截至2013年8月5日數(shù)據(jù)）進行志賀氏菌LAMP引物的設(shè)計，提供了一種快速恒溫擴增檢測志賀氏菌的方法、引物組及試劑盒。

本發(fā)明的一個目的在于提供2組引物，各含1對上下游內(nèi)引物和1對上下游外引物，引物DNA序列信息如下：

引物組A：

上游外引物F3_A：5’-GAAGAGCATGCCAACACCT-3’(SEQ ID NO：1)；

下游外引物B3_A：5’-TCCTCACAGCTCTCAGTGG-3’(SEQ ID NO：2)；

上游內(nèi)引物FIP_A：5’-CGGAATCCGGAGGTATTGCGT-TTTCCGCGTTCCTTGACC-3’(SEQ ID NO：3)；

下游內(nèi)引物BIP_A：5’-CGCTGCATGGCTGGAAAAACTC-GCAGCAACAGCGAAAGACT-3’(SEQ ID NO：4)；

引物組B：

上游外引物F3_B：5’-GGTCATTTGCTGTCACTCC-3’(SEQ ID NO：5)；

下游外引物B3_B：5’-CTGGGCAGGGAAATGTTC-3’(SEQ ID NO：6)；

上游內(nèi)引物FIP_B：

5’-GCTCGCAGAGAAACTTCAGCT-CGACACGCCATAGAAACG-3’(SEQ ID NO：7)；

下游內(nèi)引物BIP_B：5’-TGGTCTGGAAGGCCAGGTAG-CATTGCCCGGGATAAAGTC-3’(SEQ ID NO：8)。

本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種檢測志賀氏菌的試劑盒，包括能檢測志賀氏菌的基因組特異堿基序列的環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增試驗引物組，還包括Bst DNA聚合酶緩沖液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、MgSO₄和Betaine；

本發(fā)明的另一個目的在于，提供了一種志賀氏菌的方法，包括以下步驟：

（1）提取待測菌的基因組DNA；

（2）以提取的基因組DNA為模板，使用本發(fā)明的引物組進行環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增；

（3）對擴增產(chǎn)物進行檢測，通過判斷反應(yīng)結(jié)果是否為陽性，確定待測樣品中是否存在志賀氏菌；

其中，所述LAMP擴增的反應(yīng)程序為：

（1）90~98℃熱水浴0.5~3min；

（2）50℃水浴反應(yīng)0.5~3min;

（3）63℃水浴反應(yīng)0.5~2h；