[發明專利]檢測志賀氏氏菌環介導恒溫擴增試驗引物組及其應用

在審

• 申請號: 201711377805.8
• 申請日: 2017-12-19
• 公開（公告）號: CN107904320A
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發明（設計）人: 溫和心;龍英全;蔣榮華
• 申請（專利權）人: 溫和心
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 廣州市深研專利事務所44229
• 代理人: 陳雅平

1.檢測志賀氏菌環介導恒溫擴增試驗引物組，其特征在于，所述引物組的核苷酸序列分別如下所示：

引物組A：

上游外引物F3_A：5’- gaagagcatg ccaacacct-3’(SEQ ID NO：1)；

下游外引物B3_A：5’- tcctcacagc tctcagtgg-3’(SEQ ID NO：2)；

上游內引物FIP_A：5’- cggaatccgg aggtattgcg ttttccgcgt tccttgacc -3’(SEQ ID NO：3)；

下游內引物BIP_A：5’- cgctgcatgg ctggaaaaac tcgcagcaac agcgaaagac t -3’(SEQ ID NO：4)；

引物組B：

上游外引物F3_B：5’- ggtcatttgc tgtcactcc-3’(SEQ ID NO：5)；

下游外引物B3_B：5’- ctgggcaggg aaatgttc-3’(SEQ ID NO：6)；

上游內引物FIP_B：5’- gctcgcagag aaacttcagc tcgacacgcc atagaaacg-3’(SEQ ID NO：7)；

下游內引物BIP_B：5’- tggtctggaa ggccaggtag cattgcccgg gataaagtc-3’(SEQ ID NO：8)。

2.一種檢測志賀氏菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含如權利要求1所述的引物組。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，還包括作為陽性對照的小志賀氏菌的基因組DNA，作為陰性對照的不含DNA的環介導恒溫擴增體系，如雙蒸水。

4.如權利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，包括BstDNA聚合酶緩沖液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、MgSO₄和Betaine。

5.一種檢測志賀氏菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）提取待測菌的基因組DNA；

（2）以提取的基因組DNA為模板，使用如權利要求1所述引物組進行環介導恒溫擴增；

（3）通過判斷反應結果是否為陽性，確定待測樣品中是否存在志賀氏菌。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟（2）中的環介導恒溫擴增的反應程序為：

（1）90~98℃熱水浴0.5~3min；

（2）50℃水浴反應0.5~3min；

（3）63℃水浴反應0.5~2h；

（4）80℃水浴終止反應1~8min。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟（2）中L環介導恒溫擴增的反應體系中MgSO₄的終濃度為 2.5~5 mM/L，dNTPs的終濃度為1mM~4mM/L，F3和B3引物的終濃度為0.05μM/L ~0.5μM/L，FIP和BIP引物的終濃度為0.5~1μM/L，Bst DNA聚合酶的終濃度為0.2~2 U/μL，Betaine的終濃度為0.5~3 M/L。