[發(fā)明專利]預(yù)苯酸脫氫酶及其多克隆抗體

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711377195.1
• 申請日: 2017-12-19
• 公開（公告）號: CN107955807A
• 公開（公告）日: 2018-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宮春杰;顧昌祺;陶冶;胡征;楊波
• 申請（專利權(quán)）人: 湖北工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C07K16/40;C07K16/06
• 代理公司: 武漢開元知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司42104
• 代理人: 王和平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種預(yù)苯酸脫氫酶及其多克隆抗體。

背景技術(shù)

預(yù)苯酸脫氫酶，別名：預(yù)沉淀脫氫酶，英文名：prephenate dehydrogenase。預(yù)苯酸脫氫酶存在于莽草酸途徑中，對合成酪氨酸有重大作用。預(yù)苯酸脫氫酶催化預(yù)苯酸生成4-羥基苯基丙酮酸，4-羥基苯基丙酮酸通過轉(zhuǎn)氨作用生成L-酪氨酸。L-酪氨酸能夠改善記憶和精神警覺性，控制抑郁和焦慮，L-酪氨酸也是黑色素、左旋多巴等多種高價值化合物的原料，被應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)(參考文獻(xiàn)Bonuccelli U，Del Dotto P.New pharmacologic horizons in the treatment of Parkinson disease[J].Neurology,2006.67(7Suppl 2):30-38)。

目前國內(nèi)外對預(yù)苯酸脫氫酶的研究主要集中在Aquifex aeolicus、Streptococcus mutant、Haemophilus influenza以及環(huán)境未培養(yǎng)微生物，鮮見對于一些極端微生物比如耐冷，耐熱，耐酸，耐堿等微生物中預(yù)苯酸脫氫酶的研究。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決以上問題，本發(fā)明提供一種預(yù)苯酸脫氫酶及其多克隆抗體，得到了來源于耐冷微生物中的預(yù)苯酸脫氫酶，該預(yù)苯酸脫氫酶具有低溫酶的特性，而且制備得到預(yù)苯酸脫氫酶的多克隆抗體，能夠準(zhǔn)確檢測預(yù)苯酸脫氫酶。

本發(fā)明的目的之一是提供一種預(yù)苯酸脫氫酶的氨基酸序列；所述預(yù)苯酸脫氫酶序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明的目的之二是提供一種編碼預(yù)苯酸脫氫酶的氨基酸基因的堿基序列；所述預(yù)苯酸脫氫酶的氨基酸基因的堿基序列如SEQ IDNO.2所示。

本發(fā)明的目的之三是提供一種預(yù)苯酸脫氫酶的多克隆抗體的制備方法。

預(yù)苯酸脫氫酶的多克隆抗體的方法，包括以下步驟：

1)以氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的預(yù)苯酸脫氫酶為抗原，免疫小鼠制備抗血清；

2)純化抗血清得到預(yù)苯酸脫氫酶的多克隆抗體。

進(jìn)一步地，所述預(yù)苯酸脫氫酶的制備方法為：

1.1)利用PCR技術(shù)擴增SEQ ID NO.2所示的堿基序列；

1.2)將SEQ ID NO.2所示的堿基序列克隆入載體質(zhì)粒中，構(gòu)建預(yù)苯酸脫氫酶的表達(dá)載體；

1.3)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)菌體中得到重組菌體，依次經(jīng)擴大培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)、收集菌體、破碎菌體和純化蛋白過程得到預(yù)苯酸脫氫酶蛋白。

進(jìn)一步地，所述純化抗血清的方法為：將預(yù)苯酸脫氫酶蛋白與Ni-NTA偶聯(lián)制備成抗體純化層析柱，再將待純化的抗血清與PBS按照1:1比例混合后經(jīng)過抗體純化層析柱，待抗血清中的抗體與預(yù)苯酸脫氫酶蛋白結(jié)合完全后用甘氨酸洗脫緩沖液洗脫，獲得純化的預(yù)苯酸脫氫酶的多克隆抗體。

更進(jìn)一步地，所述步驟1.1)中，PCR技術(shù)擴增所用的引物為：正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示。

更進(jìn)一步地，所述步驟1.2)中載體質(zhì)粒為pET21a(+)。

更進(jìn)一步地，所述步驟1.3)中，大腸桿菌感受態(tài)菌體為大腸桿菌BL21感受態(tài)菌體。

更進(jìn)一步地，所述步驟1.3)中，所述純化蛋白過程中利用Ni-NTA親和層析色譜柱進(jìn)行蛋白純化。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1，本發(fā)明通過PCR技術(shù)在喜冷桿菌屬Cryobacterium中擴增得到預(yù)苯酸脫氫酶基因，并且通過NCBI Blast堿基序列比對證明該預(yù)苯酸脫氫酶基因堿基序列屬于喜冷桿菌屬的新的預(yù)苯酸脫氫酶基因序列。通過基因工程技術(shù)得到表達(dá)預(yù)苯酸脫氫酶蛋白的EcoliBL21-pET21a-PDG重組菌株，誘導(dǎo)表達(dá)重組菌株得到預(yù)苯酸脫氫酶蛋白，預(yù)苯酸脫氫酶為低溫酶，即在低溫條件下發(fā)揮活性，具有較好低溫的耐受力。

2，本發(fā)明以預(yù)苯酸脫氫酶為抗原得到預(yù)苯酸脫氫酶的多克隆抗體，該多克隆抗體可以準(zhǔn)確地檢測預(yù)苯酸脫氫酶蛋白。

附圖說明

圖1為PCR擴增預(yù)苯酸脫氫酶基因的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖；其中M泳道為DNA marker，1號泳道為PCR擴增預(yù)苯酸脫氫酶基因的產(chǎn)物；

圖2為表達(dá)載體pET21a-PDG的構(gòu)建示意圖；

圖3為重組菌株Ecoli BL21-pET21a-PDG表達(dá)預(yù)苯酸脫氫酶蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定圖；其中Marker泳道為protein marker；PDG泳道為預(yù)苯酸脫氫酶蛋白；