[發明專利]一種讓多化性家蠶產滯育卵的多肽、制備方法及應用

在審

• 申請號: 201711376789.0
• 申請日: 2017-12-19
• 公開（公告）號: CN108059658A
• 公開（公告）日: 2018-05-22
• 發明（設計）人: 時連根;沈張飛;蔣學;費建明
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C07K1/06;C07K17/08;C12N15/85;A01K67/04
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林超

1.一種讓多化性家蠶產滯育卵的多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNo.1，即為TDMKDESDRGAHSERGALWFGPRLa。

2.一種如權利要求1所述的讓多化性家蠶產滯育卵的多肽的制備方法，其特征在于方法步驟為：

1)將序列TDMKDESDRGAHSERGALWFGPRLa中的每一個氨基酸預先用9-芴甲氧羰基(Fmoc)基團對α-氨基進行保護處理；

2)耦聯反應：按氨基酸序列將一個已保護的氨基酸通過對烷氧芐醇支臂共價連接到不溶性的對烷氧芐醇型樹脂固相載體上，得到氨基酸--支臂--樹脂；

3)脫保護和耦聯反應：用90％質量分數的三氟乙酸(TFA)溶液對步驟2)獲得的氨基酸--支臂--樹脂進行處理，脫掉α-氨基上的9-芴甲氧羰基(Fmoc)基團，再用90％質量分數的三氟乙酸(TFA)溶液洗滌氨基酸--支臂--樹脂，然后用下一個已保護的氨基酸重復步驟2)進行耦聯反應連接到對烷氧芐醇型樹脂固相載體上；

4)重復步驟2)～3)按照序列TDMKDESDRGAHSERGALWFGPRLa的氨基酸順序對其中的全部氨基酸依次連接到對烷氧芐醇型樹脂固相載體上，得到目的多肽；

5)用氟化氫(HF)對目的多肽進行處理，水解肽鏈和固相載體之間的酯鍵，得到多肽合成液。

3.根據權利要求1所述的一種讓多化性家蠶產滯育卵的多肽的制備方法，其特征在于：所述多肽合成液中不含游離氨基，多肽合成液中的所述多肽純度在95％以上。

4.根據權利要求1所述的一種讓多化性家蠶產滯育卵的多肽的制備方法，其特征在于：所述的多肽合成液采用熒光素酶報告基因法檢測多肽的活性，活性EC50值在5.175±3.775范圍內。

5.根據權利要求4所述的一種讓多化性家蠶產滯育卵的多肽的制備方法，其特征在于：采用熒光素酶報告基因法檢測多肽的活性具體過程為：

1)將商品化的連接有cAMP反應元件(CRE)的pCRE-Luc熒光素酶報告基因質粒和家蠶滯育激素受體(BmDHR)質粒瞬時轉染到HEK293細胞系中，篩選得到能同時穩定表達兩種質粒的細胞株；

2)將細胞株擴大培養后接種至多孔細胞培養板中生長培養，加入多肽合成液，多肽合成液以無血清的細胞培養基(DMEM)稀釋成不同濃度(范圍1×10-6摩爾～1×10-13摩爾)后，分別加入多孔細胞培養板中，在37℃培養箱中刺激細胞4-6小時；

3)使用熒光素酶檢測試劑盒檢測：首先在每孔細胞培養板中加入40μL熒光素酶裂解液，裂解15分鐘；再從每孔細胞培養板中取30μL細胞裂解產物到多孔檢測板上，每孔檢測板中再加入15μL熒光素酶檢測液，混合后反應10分鐘；最后用多孔閃爍發光計數儀檢測每個孔的CRE熒光素酶活性，獲得熒光值與其對應的多肽濃度作用曲線，算出EC50值。

6.一種讓多化性家蠶產滯育卵的多肽的應用，其特征在于：權利要求1所述多肽或者權利要求2所述方法獲得的活性多肽，用于注入多化性家蠶蛹體內使得家蠶產下滯育卵。

7.根據權利要求6所述的一種讓多化性家蠶產滯育卵的多肽的應用，其特征在于：給每代均產非滯育卵的多化性品種家蠶化蛹后2-3天的雌蠶蛹腹部注射120-140nM的所述活性多肽(家蠶DH活性多肽)，置于24-25℃溫度、70-80％濕度、晝明夜暗的環境中保護，待化蛾后正常交配，產下滯育卵。