[發明專利]一種編輯豬屬胎兒成纖維細胞中的BMPR-IB基因方法

在審

• 申請號: 201711376703.4
• 申請日: 2017-12-19
• 公開（公告）號: CN108048487A
• 公開（公告）日: 2018-05-18
• 發明（設計）人: 幸宇云;任軍;楊強;喬傳民;黃路生
• 申請（專利權）人: 江西農業大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N9/22
• 代理公司: 北京聿華聯合知識產權代理有限公司 11611
• 代理人: 劉建軍;蘇艷桃

本申請提供了一種編輯豬屬(Sus)胎兒成纖維細胞中的BMPR?IB基因方法，其包括如下步驟：1)建立待編輯的豬屬胎兒成纖維細胞；2)確定待編輯的豬屬BMPR?IB基因中與羊的BMPR?IB基因746GG相應的位點為746AA；3)利用CRISPR/Cas系統將所述BMPR?IB基因第746位的堿基AA編輯為堿基AG或GG。

技術領域

本申請提供了一種編輯豬屬胎兒成纖維細胞中的BMPR-IB基因方法，特別是涉及利用CRISPR/Cas9系統對豬屬胎兒成纖維細胞中的BMPR-IB基因第746位的堿基A編輯為堿基G的方法。

背景技術

我國是世界最大的豬肉生產國和消費國，2015年，豬肉產量5671.39萬噸，占全國肉類總產量的65％左右。產仔性狀是養豬生產中的重要經濟性狀，我國現有能繁母豬4300萬頭，如果每頭母豬平均每胎多產仔1頭，則全國每年可增產近9000萬頭商品豬。但產仔性狀的選育改良很難，丹麥花了近50年的時間才將長白豬的窩產仔數量提高了1頭。

BMPR-IB基因被證明是導致Booroola Merino羊的多胎性能的主效基因，其編碼區A746G位點(SEQ ID No.1的第902bp處，BMPR-IB基因CDS序列為157至1665位))的G為有利等位基因，對排卵數呈加性效應。研究表明，每一個BMPR-IB有利等位基因(G)平均增加排卵數1.5～1.65個，增加產羔數0.9～1.2個；兩個拷貝(GG)平均增加排卵數2.7～3.0個，增加產羔數1.1～1.7個。在表型上有利突變型Booroola Merino母羊(BB)平均排卵4.65個，顯著高于對照組排卵數1.62個。現有的報道表明，A746G的G有利等位基因僅在綿羊和山羊中發現，在豬等其它哺乳動物中未發現存在G有利等位基因。豬與綿羊的BMPR-IB基因cDNA序列的同源性僅達到86％。

基因組編輯是指利用特異性的核酸酶，通過同源介導修復(HDR)和非同源末端連接(NHEJ)修復機制以實現外源DNA的插入、刪除或替換，從而在基因組水平對基因及其調控元件進行定向修飾的一種基因工程手段。迄今為止，成功應用于基因組編輯的特異性核酸酶包括ZFN(鋅指核酸酶)、TALEN(轉錄激活子樣效應因子核酸酶)和CRISPR/Cas(成簇規律間隔短回文重復序列)。最近幾年呈現出爆發式發展的CRISPR/Cas9技術因其相比ZFN和TALEN更方便、快捷、高效和低成本。CRISPR/Cas是一種后天性免疫系統，在約40％細菌、幾乎所有的古細菌和少量噬菌體中均存在。根據CRISPR基因座和Cas基因的不同，CRISPR/Cas體系目前被分成I、II和III型，作為II型的CRISPR/Cas9是三類體系中結構較簡單的一種。CRISPR/Cas9基因組編輯基本原理是：靶位點特異性crRNA和輔助的tracrRNA形成gRNA(嵌合向導RNA)，指引Cas9蛋白切割目標區域的DNA序列，目標區域為PAM(原型間隔序列毗鄰基序)前的gRNA識別序列，其中Cas9的HNH結構域切割與crRNA互補配對的模板鏈，Cas9的RuvC結構域切割含有PAM的鏈。人工改造的CRISPR/Cas9系統將tracrRNA和crRNA雙組分利用基因工程整合為一條鏈，稱為sgRNA(單鏈引導RNA)；將人工設計的針對某個目的基因的sgRNA序列連接在CRISPR/Cas9質粒上，即可針對該基因開展基因組編輯工作。

發明內容

本申請提供了一種編輯豬屬(Sus)胎兒成纖維細胞中的BMPR-IB基因方法，其包括如下步驟：

1)建立待編輯的豬屬(Sus)胎兒成纖維細胞；

2)確定待編輯的豬屬BMPR-IB基因中與羊的BMPR-IB基因746GG相應的位點為746AA；

3)利用CRISPR/Cas系統將所述豬屬BMPR-IB基因第746位的堿基AA編輯為堿基AG或GG。

在一個具體實施方式中，在步驟3)中，所述CRISPR/Cas系統為CRISPR/Cas9系統，連接sgRNA之前的質粒載體為PX458。