[發明專利]一種編輯豬屬胎兒成纖維細胞中的BMPR-IB基因方法

在審

• 申請號: 201711376703.4
• 申請日: 2017-12-19
• 公開（公告）號: CN108048487A
• 公開（公告）日: 2018-05-18
• 發明（設計）人: 幸宇云;任軍;楊強;喬傳民;黃路生
• 申請（專利權）人: 江西農業大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N9/22
• 代理公司: 北京聿華聯合知識產權代理有限公司 11611
• 代理人: 劉建軍;蘇艷桃

1.一種編輯豬屬(Sus)胎兒成纖維細胞中的BMPR-IB基因方法，其包括如下步驟：

1)建立待編輯的豬屬胎兒成纖維細胞；

2)確定待編輯的豬屬BMPR-IB基因中與羊的BMPR-IB基因746GG相應的位點為746AA；

3)利用CRISPR/Cas系統將所述豬屬BMPR-IB基因第746位的堿基AA編輯為堿基AG或GG。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟3)中，所述CRISPR/Cas系統為CRISPR/Cas9系統，連接sgRNA之前的質粒載體為PX458。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步驟3)中，在待編輯的豬屬胎兒成纖維細胞的染色體DNA序列中確定CRISPR/Cas9系統中使用的PAM序列，將位于所述PAM序列上游的17至22個堿基確定為編輯BMPR-IB基因第746位堿基的sgRNA，將所述sgRNA連接到所述PX458上，得到PX458-BMPR-IB-746G；優選所述PAM序列為SEQ ID No.2中第1206位至第1208位的GGG；更優選地，所述sgRNA的序列如SEQ ID No.3所示。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，在步驟3)中，所述sgRNA連接到所述PX458上的過程如下：

3-1-I)利用BbsI限制性內切酶對PX458進行線性化，得到線性化的PX458質粒；

3-1-II)設計所述sgRNA的正向引物和反向引物；所述正向引物中含有能夠與所述線性化的PX458質粒的粘性末端互補的BbsI限制性內切酶酶切位點的粘性末端CACC，所述反向引物中含有能夠與所述線性化的PX458質粒的粘性末端互補的BbsI限制性內切酶酶切位點的粘性末端AAAC；將所述正向引物和反向引物退火成雙鏈，得到sgRNA雙鏈片段；

3-1-III)在含有連接酶的體系中將線性化的PX458質粒與sgRNA雙鏈片段進行連接，得到連接產物；

3-1-IV)將所述連接產物轉化到感受態大腸桿菌中，篩選出陽性連接產物PX458-BMPR-IB-746G。

5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，在步驟3)中，確定與所述PX458-BMPR-IB-746G配合的供體DNA的序列；在所述供體DNA的序列中包含BMPR-IB基因的746G以及sgRNA序列，并且sgRNA序列下游的3個堿基不能為PAM序列，所述供體DNA的其他序列與待編輯的豬屬胎兒成纖維細胞的染色體DNA序列一致；優選所述供體DNA的序列具有300bp至3kb的長度；更優選供體DNA的序列具有500bp至1000bp的長度；最優選所述供體DNA的序列如SEQ IDNo.20所示，其中與所述染色體DNA中的所述PAM序列對應的序列為GGC。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，在步驟3)中，將所述PX458-BMPR-IB-746G和所述供體DNA序列轉染到所述豬屬胎兒成纖維細胞中，并篩選BMPR-IB基因的746AA突變為AG雜合子或GG純合子的陽性克隆，過程如下：

3-2-I)將0至3代的所述豬屬胎兒成纖維細胞進行培養，培養液為包括青霉素、鏈霉素，以及體積含量18％-22％胎牛血清的高糖DMEM；待細胞匯合度達90％以上時，將PX458-BMPR-IB-746G、供體DNA、PX459v2以及DNA連接酶IV抑制劑SCR7混合，并轉染豬胎兒成纖維細胞；

3-2-II)利用PCR測序法篩選陽性克隆。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，轉染豬胎兒成纖維細胞所用的所述PX458-BMPR-IB-746G、供體DNA和PX459v2的質量比為(1.8-2.2)：(1.8-2.2)：1；優選轉染400-600萬個豬胎兒成纖維細胞所用的所述PX458-BMPR-IB-746G、供體DNA和PX459v2的用量依次為25μg、25μg，和12.5μg。