[發(fā)明專利]酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)印跡的自身免疫檢測試劑盒及其操作流程

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201711375909.5
• 申請日: 2017-12-19
• 公開（公告）號(hào): CN108152503A
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄒永龍;馬欣
• 申請（專利權(quán)）人: 上海瀾帆實(shí)業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/66
• 分類號(hào): G01N33/66;G01N33/531
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)印跡的自身免疫檢測試劑盒及其操作流程，一種基于酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)印跡技術(shù)的自身免疫檢測試劑盒包括盒體、靶標(biāo)分子及試劑，其特征在于：所述試劑盒是一種基于酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)印跡與富集相結(jié)合的技術(shù)，用于檢測自身免疫功能的缺陷導(dǎo)致的血糖異常的試劑盒，所述靶標(biāo)分子是抗原(ICA、IAA、GAD、PTPRN、1A-2A、ZnT8A)純化后的多肽經(jīng)過標(biāo)定以后，稀釋至20-100微克每毫升以后，被鋪被到96孔的PVDF膜上，然后用牛血清蛋白作封閉處理，最后經(jīng)過特殊干燥工藝和真空封膜處理后可長期保存，所述試劑包括細(xì)胞裂解液、抗人免疫細(xì)胞抗體、免疫細(xì)胞富集及擴(kuò)增培養(yǎng)基，所述細(xì)胞裂解液主要成分是HEPES0.1-0.3M，氯化鋁0.15-0.3M，EDTA鉀0.1-0.4M，碳酸鉀0.2-0.4M，0.35-0.6M甘油等，所述抗人免疫細(xì)胞抗體是通過從山羊或小鼠制備的抗人免疫細(xì)胞抗體，所述擴(kuò)增培養(yǎng)基一種用于免疫細(xì)胞上，使其增加細(xì)胞生長和刺激因子的RPMI1640擴(kuò)增培養(yǎng)基；

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)印跡的自身免疫檢測試劑盒及其操作流程，包括以下幾個(gè)操作流程：

1)制備靶標(biāo)分子：經(jīng)篩選選定的靶標(biāo)分子(ICA、IAA、GAD、PTPRN、1A-2A、ZnT8A)，通過序列分析，選定了抗體由100-200個(gè)氨基酸組成的多肽，通過分子克隆和大腸桿菌表達(dá)的方式來表達(dá)這些多肽。通過分子復(fù)性的技術(shù)手段使得這些多肽得以分離純化，經(jīng)由上述過程純化后的多肽經(jīng)過脫鹽處理，保存于磷酸緩沖液內(nèi)置于-20℃長期保存。

2)制備靶標(biāo)分子的覆被裝置：在流程1)的基礎(chǔ)之上，將(ICA、IAA、GAD、PTPRN、1A-2A、ZnT8A)純化后的多肽經(jīng)過標(biāo)定以后，稀釋至20-100微克每毫升以后，被鋪被到96孔的PVDF膜上，然后用牛血清蛋白作封閉處理，最后經(jīng)過特殊干燥工藝和真空封膜處理后可長期保存。

3)制備細(xì)胞裂解液：細(xì)胞裂解液主要成分是HEPES0.1-0.3M，氯化鋁0.15-0.3M，EDTA鉀0.1-0.4M，碳酸鉀0.2-0.4M，0.35-0.6M甘油等。使用前用無菌純凈水稀釋該細(xì)胞裂解液1:10，于室溫避光存放，人血液用含肝素鈉或EDTA的無菌管新鮮采集，先離心3分鐘去除血漿，然后加入3毫升細(xì)胞裂解液，震蕩混勻于室溫處理15分鐘，離心收集白細(xì)胞部分，用細(xì)胞清洗液0.1-0.2MPBS洗滌一次后備用。

4)制備抗人免疫細(xì)胞抗體及免疫細(xì)胞富集：此制劑是通過從山羊或小鼠制備的抗人免疫細(xì)胞抗體，向每一個(gè)分離的外周血細(xì)胞加入5微升該抗體制劑，混勻后在冰上放置15分鐘，然后加入經(jīng)特異修飾過的磁珠吸附這些免疫細(xì)胞，在緩沖液清洗以后，特異性的免疫細(xì)胞通過磁性有效分離得以富集和濃縮。

5)制備擴(kuò)增培養(yǎng)基：經(jīng)過添加特殊生長因子和化合物后制成的擴(kuò)增培養(yǎng)液(RPMI1640)可以有效激活相關(guān)免疫細(xì)胞的復(fù)制和自體免疫蛋白的合成和分泌過程，從而大幅度提高微量自體免疫蛋白的被檢測概率和靈敏度。

6)檢測靶標(biāo)分子：經(jīng)分離濃縮后的免疫細(xì)胞使用細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液懸浮以后被均勻分布到每一個(gè)96孔里，于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18-20小時(shí)以后取出。PVDF膜經(jīng)過含去垢劑的磷酸緩沖液清洗數(shù)次以后，于每一96孔內(nèi)加入試劑盒一抗孵育2小時(shí)。經(jīng)清洗后，于每一96孔內(nèi)加入試劑盒二抗孵育0.5小時(shí)。經(jīng)清洗后，加入顯色試劑后孵育0.5-1小時(shí)。終止顯色反應(yīng)，清洗和干燥處理以后，使用ELISPOT實(shí)驗(yàn)讀板機(jī)和軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

7)臨床樣品檢測數(shù)據(jù)分析：自身免疫功能的缺陷導(dǎo)致的血糖異常的靶標(biāo)分子的分析測定及陰性，弱陽性，強(qiáng)陽性，假陽性結(jié)果的檢測與數(shù)據(jù)分析。