[發明專利]人溶菌酶基因的合成及其表達產物的構建方法

在審

• 申請號: 201711374919.7
• 申請日: 2017-12-19
• 公開（公告）號: CN108165567A
• 公開（公告）日: 2018-06-15
• 發明（設計）人: 劉燊;李浩杰;張輝華;楊雪珍;林樹茂
• 申請（專利權）人: 佛山科學技術學院
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N15/81;C12N9/36
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 謝泳祥

本發明提供了一種人溶菌酶基因的合成及其表達產物的構建方法。所述人溶菌酶基因根據hLZ原基因序列和hLZ氨基酸序列，在不改變其氨基酸序列的前提下，將畢赤酵母稀有密碼子優化成畢赤酵母常用密碼子。通過優化人溶菌酶基因片段的密碼子，使其在真核表達時能夠得到產量高、純度高的人溶菌酶重組蛋白。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域。

背景技術

人溶菌酶(human lysozyme，hLZ)屬于溶菌酶家族的c型，由130個氨基酸組成的堿性多肽，分子量為14.7KDa，等電點為11。人溶菌酶基因位于12號染色體長臂上(12q15)，序列全長6807bp(GenBank序列號：X14008)，含有4個外顯子和3個內含子。人溶菌酶是人體的一種非特異性免疫物質，廣泛存在于人體體液中，如乳汁、淚液、唾液、鼻黏液、尿液、腦脊液、子宮頸黏液以及羊水等，同時也存在于呼吸道和腸道組織中。

人溶菌酶具有殺菌消炎作用，它水解細菌細胞壁肽聚糖N-乙酰葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine，NAG)與N-乙酰氨基葡萄糖乳酸(N-acetylmuramic acid，NAM)之間的β-1，4糖苷鍵，從而破壞細菌的細胞壁。溶菌酶還具有調節炎癥反應的能力，它結合脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)和脂磷壁酸(Lipteihcoicacid，LTA)，防止其與腸上皮細胞(Intestinal epithelial cells，IEC)和腸巨噬細胞上的受體相互作用；溶菌酶還對LPS具有螯合作用，抑制引發促炎癥反應；溶菌酶對中性粒細胞也具有顯著的免疫調節作用，減少對幾種促炎癥因子的產生，降低中性粒細胞中的氧化代謝但不抑制吞噬作用。因此，人溶菌酶可廣泛應用于食品保鮮、嬰幼兒奶粉、抗菌消炎藥和抗生素替代等方面。

目前，人溶菌酶主要來源于人乳汁或人胎盤等，因原料來源受限及分離純化成本較高，從而限制了其應用。國內雖有利用基因工程菌生產hLY的報道，但酶產量和活性均較低，質量不穩定。

發明內容

本發明旨在分析人溶菌酶基因序列，在不改變其氨基酸序列的前提下，將其中的密碼子由畢赤酵母稀有密碼子優化成畢赤酵母常用密碼子，進而表達出產量高、純度高的人溶菌酶。

本發明所采取的技術方案是：

一種人溶菌酶基因針對畢赤酵母優化表達的序列，其根據hLZ原基因序列：

AAGGTTTTCGAAAGGTGCGAATTGGCTAGAACTTTGAAGAGATTGGGAATGGACGGTTACAGAGGCATTTCTTTGGCAAATTGGATGTGCTTGGCTAAGTGGGAATCAGGTTACAACACTAGAGCTACTAATTATAACGCCGGCGATAGATCTACCGATTACGGCATTTTCCAGATCAACTCCAGATATTGGTGCAACGACGGTAAAACACCAGGAGCAGTTAACGCTTGTCATTTGTCTTGTTCCGCCTTGTTGCAAGATAATATTGCCGATGCAGTTGCTTGCGCTAAAAGAGTTGTTAGAGATCCACAAGGAATTAGAGCTTGGGTTGCTTGGAGAAATAGGTGCCAAAATAGAGACGTTAGACAATACGTTCAAGGTTGCGGAGTT(SEQ ID No.2)，

和hLZ氨基酸序列：

KVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGVHHHHHH(SEQ ID No.3)，