[發明專利]一種可用于孤核受體活性調節劑篩選的雙熒光素酶報告基因質粒及其構建與應用

有效

• 申請號: 201711374109.1
• 申請日: 2017-12-19
• 公開（公告）號: CN107893085B
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發明（設計）人: 夏李群;李恭會;沈丹陽
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/65;C12N15/66;C12Q1/66
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 萬尾甜;韓介梅

本發明公開了一種可用于孤核受體活性調節劑篩選的雙熒光素酶報告基因質粒，為含受DR1的螢火蟲熒光素酶以及內參海腎熒光素酶嵌合質粒(p?TK?(DR1)₃?Fluc?hRluc)，其構建方法是將如SEQ ID NO.1的片段插入到商品化質粒pmirGLO經NheI/BglII雙酶切后得到帶有hRluc的骨架質粒中。通過將該質粒與孤核受體過表達質粒共轉染細胞，利用雙熒光素酶活力檢測可實現孤核受體活性調節劑的高效篩選，方法操作簡單，靈敏度高、專屬性強。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種雙熒光素酶報告基因質粒的構建，該質粒可用于孤核受體活性調節劑篩選。

背景技術

孤核受體是沒有配體或尚未發現配體的核受體。目前，已發現了150余種孤核受體，有些孤核受體參與了動物體的代謝調節、胚胎發育、細胞分化和基因表達等。近年來，隨著部分孤核受體活性調節劑的發現，尤其是內源性激動劑的發現，已發展成為配體依賴性核受體，如視黃酸X受體、法尼酸X受體、過氧化物酶體增生激活受體γ等。由此可見，孤核受體活性調節劑的發現不僅可以加深了我們對孤核受體作用的認識，而且還有助于靶向調控孤核受體類新藥的開發。

孤核受體作用元件(HREs,hormone response elements)最先是在研究維生素D受體、甲狀腺激素受體和維生素A受體等核受體作用時發現的。HREs通常位于核受體的作用靶基因啟動子序列中,孤核受體的DBD可識別并結合之。HREs一般有兩個重復性序列組成，致使DNA與孤核受體的結合具有更好的穩定性。根據組合序列的不同，HREs可分為三種形式:直接重復序列(DRs,direct repeats)、外翻重復序列(ERs,everted repeats)和內翻重復序列(IRs,inverted repeats)，其中DRs是最常見的。由于DRs中兩半末端序列間的間距堿基數目差異,DRs又有DR1、DR2、DR3、DR4和DR5五種。間距堿基的數目可影響孤核受體與DNA結合時的空間構型,因此對孤核受體與DNA結合力具有重要意義。

目前孤核受體活性調節劑的篩選主要依賴于雙熒光素酶報告基因系統三質粒系統實現。實驗操作中需要同時瞬時轉染孤核受體過表達質粒、受孤核受體活性調控表達的螢火蟲熒光素酶質粒pGL3-(DR1)₃以及內參質粒pRL-TK。此方法穩定性差，操作復雜，勞動強度大，不能適應大量藥品的同時篩選。所以建立穩定、便捷的孤核受體活性調節劑的篩選方法具有重要的現實意義。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種可用于孤核受體活性調節劑篩選的雙熒光素酶報告基因質粒及其構建與應用，本發明通過構建含受體DR1的螢火蟲熒光素酶以及內參海腎熒光素酶嵌合質粒(p-TK-(DR1)₃-Fluc-hRluc)，即將如SEQ ID NO.1的片段插入到商品化質粒pmirGLO經NheI/BglII雙酶切后得到帶有hRluc的骨架質粒中。通過將該質粒與孤核受體過表達質粒共轉染細胞，利用雙熒光素酶活力檢測實現孤核受體活性調節劑的高效篩選。該方法操作簡化，靈敏度高、專屬性強。

本發明的雙熒光素酶報告基因質粒的構建方法包括如下步驟實驗：

1)將帶有BglII和HindIII酶切位點序列的擴增mini-TK啟動子引物，以pGL3-basic質粒為模板進行擴增得到啟動子，酶切后克隆到pGL3-basic質粒中，得到pGL3-TK質粒；所述的引物的正向序列如SEQ ID NO.2，反向序列如SEQ ID NO.3；

2)將帶有NheI和BglII內切酶的(DR1)₃片段克隆到pGL3-TK質粒中，得到pGL3-TK-(DR1)₃質粒；所述的(DR1)₃片段堿基序列為由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5形成的DNA雙鏈；

3)將pGL3-TK-(DR1)₃質粒用NheI/BamHI雙酶切，得到TK-(DR1)₃片段；