[發(fā)明專利]一種可用于孤核受體活性調(diào)節(jié)劑篩選的雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒及其構(gòu)建與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711374109.1
• 申請日: 2017-12-19
• 公開（公告）號: CN107893085B
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏李群;李恭會;沈丹陽
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/65;C12N15/66;C12Q1/66
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 萬尾甜;韓介梅

1.一種雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，其特征在于，所述的質(zhì)粒為含受體DR1的螢火蟲熒光素酶以及內(nèi)參海腎熒光素酶嵌合質(zhì)粒；

所述的質(zhì)粒為p-TK-(DR1)₃-Fluc-hRluc，是將TK-(DR1)₃片段插入骨架質(zhì)粒而得到的，所述的骨架質(zhì)粒是pmirGLO質(zhì)粒用NheI/BglII雙酶切得到帶有hRluc的骨架質(zhì)粒，所述的TK-(DR1)₃片段的堿基序列如SEQ ID NO.1。

2.一種構(gòu)建如權(quán)利要求1所述的雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)將帶有BglII和HindIII酶切位點(diǎn)序列的擴(kuò)增mini-TK啟動子引物，以pGL3-basic質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增得到啟動子，酶切后克隆到pGL3-basic質(zhì)粒中，得到pGL3-TK質(zhì)粒；所述的引物的正向序列如SEQ ID NO.2，反向序列如SEQ ID NO.3；

2)將帶有NheI和BglII內(nèi)切酶的(DR1)₃片段克隆到pGL3-TK質(zhì)粒中，得到pGL3-TK-(DR1)₃質(zhì)粒；所述的(DR1)₃片段為由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5形成的DNA雙鏈；

3)將pGL3-TK-(DR1)₃質(zhì)粒用NheI/BamHI雙酶切，得到TK-(DR1)₃片段；

4)將pmirGLO質(zhì)粒用NheI/BglII雙酶切得到帶有hRluc的骨架質(zhì)粒；

5)將步驟3)得到的TK-(DR1)₃片段和步驟4)中所得到的骨架質(zhì)粒通過T4連接酶連接，得到雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒p-TK-(DR1)₃-Fluc-hRluc。

3.一種如權(quán)利要求1所述的雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒的應(yīng)用，其特征在于，將該質(zhì)粒用于孤核受體活性調(diào)節(jié)劑的篩選。

4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，具體如下：

(1)用雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒p-TK-(DR1)₃-Fluc-hRluc與孤核受體過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞；

(2)轉(zhuǎn)染24-36小時(shí)后，加入待檢測化合物，裂解細(xì)胞，檢測細(xì)胞裂解液的螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性比值，與未加入化合物的對照組相比較，獲得待檢測化合物對孤核受體活性的調(diào)控效果。