[發明專利]一種具有抗腫瘤活性的三元復合毒素及其制備方法

有效

• 申請號: 201711373010.X
• 申請日: 2017-12-19
• 公開（公告）號: CN108048471B
• 公開（公告）日: 2021-07-20
• 發明（設計）人: 胡勝標;胡曉鳳;謝亞麗;張國勇;楊曦;夏立秋;丁學知;彭智輝
• 申請（專利權）人: 湖南師范大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C07K14/24;A61K38/16;A61P35/00
• 代理公司: 長沙星耀專利事務所(普通合伙) 43205
• 代理人: 張慧;趙靜華

1.三元復合毒素在制備抑制Hela細胞的藥物中的用途，其特征在于，所述三元復合毒素的編碼基因來源于昆蟲病原線蟲共生致病桿菌Xenorhabdus stockiae HN_xs01，為xsrfABC基因，xsrfABC基因包含三個開放閱讀框：xsrfA、xsrfB和xsrfC，xsrfA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示，xsrfB的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 2所示，xsrfC的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 3所示；xsrfA基因編碼的蛋白氨基酸序列如序列表SEQID NO: 4所示，xsrfB基因編碼的蛋白氨基酸序列如序列表SEQ ID NO: 5所示，xsrfC基因編碼的蛋白氨基酸序列如序列表SEQ ID NO: 6所示。

2.根據權利要求1所述的用途，其特征在于，所述三元復合毒素的制備方法包括以下步驟：首先提取了Xenorhabdus stockiae HN_xs01的基因組，構建了基因組fosmid文庫，篩選對Hela細胞具有毒性的克隆子，對克隆子進行測序分析，將xsrfABC基因克隆獲得表達載體pSC101-BAD-xsrfABC，將表達載體轉化入GB05，得到重組菌株GB05，誘導表達XSrfABC毒素。

3.根據權利要求2所述的用途，其特征在于，所述三元復合毒素的制備方法還包括以下步驟：分別構建了XSrfA、XSrfB和XSrfC的原核表達載體，誘導表達復合毒素的各組分，并利用親和層析純化毒素蛋白，將三種組分混合。

4.根據權利要求3所述的用途，其特征在于，所述三元復合毒素的制備方法還包括以下步驟：PCR分別擴增xsrfA、xsrfB和xsrfC基因片段，并克隆到表達質粒pGEX-4T-2，獲得三個重組質粒：pGEX-4T-srfA，pGEX-4T-srfB，pGEX-4T-srfC；

將三個重組質粒分別電轉至E. coli BL21中，獲得重組菌株BL21-SrfA、BL21-SrfB、BL21-SrfC；三種重組菌株經IPTG誘導后，均表達可溶性的目的蛋白；將三種可溶性表達蛋白的菌體上清用0.22 μm濾膜過濾，用清洗緩沖液清洗GST瓊脂糖樹脂，加入蛋白裂解液，加入5倍柱體積的洗滌緩沖液洗脫蛋白，重復洗脫一次，加入2倍柱體積Elution buffer洗脫，收集蛋白，將分別表達再收集的三種蛋白混合。