[發明專利]一種苦蕎籽粒RNA的快速提取方法

在審

• 申請號: 201711372936.7
• 申請日: 2017-12-19
• 公開（公告）號: CN107841499A
• 公開（公告）日: 2018-03-27
• 發明（設計）人: 王迅;張賢聰;黎媛;汪志輝;唐懿;王進
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 成都帝鵬知識產權代理事務所(普通合伙)51265
• 代理人: 黎照西

技術領域

本發明屬于生物基因技術領域，具體涉及一種苦蕎籽粒RNA的快速提取方法。

背景技術

苦蕎，又名韃靼蕎麥，屬于蓼科蕎麥屬，是一種藥食兩用性作物，苦蕎的活性成分富含黃酮類化合物、酚類化合物、肌醇、弱堿性淀粉和活性蛋白，是能當飯吃的食品，且其營養成分豐富，本身就富含硒，可以對人體起到自然補充硒的作用，有著卓越的營養保健價值和非凡的食療功效。我國苦蕎種植面積和產量均居世界第一位，主要生長在我國的西南山區，四川地區的苦蕎茶也流傳甚廣。

RNA的提取是分子生物學研究的一個重要組成部分，是提取無污染的完整的RNA是進行基因表達分析和基因克隆的必要條件，從細胞中分離RNA的純度與完整性對后續進行Northern雜交分析、RT-PCR及蛋白質的體外翻譯等分子生物學研究都至關重要。然而，由于植物細胞具有堅硬的細胞壁，且植物細胞內含有多酚、多糖、萜類或其它無法確定的次級代謝產物，在完整的細胞內這些物質與核酸是相互分離的，但當組織被研磨，細胞被破碎后，這些物質就會與RNA相互作用，因而從植物組織中極難分離出高質量的RNA。

中國專利文獻CN 106967711 A中公布了一種蕎麥RNA的優化提取方法，其采用CTAB提取緩沖溶液提取蕎麥根、莖和葉不同部位的RNA，能夠去除多糖和酚類等物質，獲得了較高濃度的和純度的RNA，然而該方法采用高鹽濃度的緩沖液體系，在很好溶解DNA的同時也造成了部分RNA的損失，且其采用傳統的氯仿-異戊醇萃取步驟，需要進行多步重復萃取才能獲得純度高的RNA，不僅耗時耗力，而且易造成RNA的損失，提取效率較低，且其在4℃下經多次離心，裂解液容易變粘稠而不易吸取，其采用高壓濕熱滅菌消毒，耗費時間較長。另外，由于同一種方法在不同植物組織中提取效果有所差異；即使同一種植物的不同組織其RNA提取方法也會有很大的不同，因而CN 106967711A的方法并不適用于苦蕎籽粒的提取，提取效果較差。

發明內容

本發明的目的就是為了解決上述技術問題，而提供一種苦蕎籽粒RNA的快速提取方法，本發明的提取方法經電泳檢測時條帶清晰，RNA完整性好，OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值在1.8～2.0之間，能夠獲得較高純度的RNA，且RNA損失少，提取濃度高，RNA產率高，可用于基因表達分析或分子克隆等分子生物學研究。

為了實現上述目的，本發明采用的技術方案為：一種苦蕎籽粒RNA的快速提取方法，包括以下步驟：

(1)滅菌處理：對所用器皿和器具進行乙醇灼燒滅菌，并在操作前預冷；

(2)在離心管中加入65℃預熱后的CTAB提取液，然后加入β-巰基乙醇混勻，再加入研磨成粉末狀的苦蕎籽粒樣品進行劇烈混勻；所述CTAB提取液配方為：2％CTAB(W/V)，60mM Tris-HCl，25mM EDTA，15％無水乙醇，pH為8.0；

(3)將離心管置于65℃水浴處理15～20min，水浴完畢后取出，于常溫下12000rpm離心10min；

(4)吸取步驟(3)離心后所得上清液于新管，加入等體積的配比為24:1的氯仿-異戊醇混合液，混勻1min，然后加入pH為4.6的醋酸鉀使其終濃度為1.2M，充分混勻后冰浴15min，常溫下12000rpm離心10min，吸取上清液于新管；

(5)向步驟(4)離心后所得上清液中加入等體積的LiCl溶液使其管內終濃度為2M，-20℃下靜置沉淀2h，取出于4℃下12000rpm離心10min，傾棄液體，將管底沉淀物用乙醇漂洗，短離心后晾干乙醇，向沉淀物中加入重蒸水溶解，做電泳檢測。

本發明提供的上述苦蕎籽粒RNA提取方法，充分利用了CTAB的較強洗滌性能，通過CTAB提取液配方，能夠從苦蕎籽粒的細胞膜和蛋白質中釋放RNA，在CTAB提取液體系中，蛋白質和大多數多聚糖可與CTAB形成復合物而沉淀除去，同時CTAB破壞了蛋白質在水中存在的兩個因素(水化層和電荷)，蛋白質和雜質除去效果好。此時核酸無法沉淀出來，在后續的離心和萃取過程中再進一步除去DNA和酚類物質，從而獲得高質量的RNA提取物。在步驟(2)的CTAB提取液中加入15％的無水乙醇(指無水乙醇的體積占提取液總體積的15％)是非常必要的，加入的無水乙醇可以使RNA更好的分離溶解，大大減少沉淀過程中RNA的損失。在本發明的探索實驗中，沒有加入無水乙醇(總體積的15％)的情況下，最終得到的RNA質量和產率均不高。