[發明專利]重組精氨酸脫亞胺酶及其產業化制備方法和應用

有效

• 申請號: 201711371748.2
• 申請日: 2017-12-19
• 公開（公告）號: CN108265068B
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: 馬永;趙百學;王俊
• 申請（專利權）人: 江蘇眾紅生物工程創藥研究院有限公司
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/78;C12N15/70;C12N1/21;A61K38/50;A61P35/00
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本發明提供了重組精氨酸脫亞胺酶及其編碼基因、制備方法、應用。本發明針對大腸桿菌表達系統對編碼基因、載體、菌株、制備工藝及緩沖體系都進行了全面的優化及篩選，相比密碼子優化前，優化后的精氨酸脫亞胺酶編碼基因重組表達獲得的精氨酸脫亞胺酶表達量和活性都有了大幅提高。同時，本專利通過對重組精氨酸脫亞胺酶重組菌發酵工藝的優化，可穩定獲得高產量及活性的目的蛋白。此外，本專利還提供了體系優良的重組精氨酸脫亞胺酶酶活測定系統，真實的反應了重組蛋白的酶活。體外活性表明，本專利提供的重組精氨酸脫亞胺酶可有效抑制多種腫瘤細胞的生長，具有廣闊的藥用前景及產業化生產可能性。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及重組精氨酸脫亞胺酶(以下簡稱rADI)及其編碼基因、產業化制備方法和應用。

背景技術

精氨酸是人體的一種非必需氨基酸，可以經尿素循環獲得，而精氨酸缺陷型腫瘤因缺少ASS(Argininosuccinate Synthetase)所以細胞無法合成精氨酸，因此其生長需要從外部環境中攝取精氨酸。經研究表明，精氨酸脫亞胺酶(Arginine deiminase,EC3.5.3.6，簡稱ADI)能夠降解環境中的精氨酸，從而抑制這些精氨酸缺陷型腫瘤的生長，達到殺死癌細胞治療癌癥的目的。這種新型的“精氨酸剝奪療法”可以用于某些精氨酸營養缺陷型癌細胞的治療，例如肝癌細胞和黑素瘤細胞。在這之前，已經有類似的“饑餓療法”用于一些腫瘤的治療中。

ADI廣泛存在于細菌和真核細胞內，自從1933年F.Horn首次報道了綠膿假單胞菌(Pesudomonas pyocyaneum)中含有ADI后，之后很多來源于不同微生物的ADI相繼被報道，其中包括假單胞菌、支原體、鹽桿菌和乳球菌等。來源于不同微生物的ADI在酶活及性質方面差別較大，最適反應pH范圍在5.6到7.6之間，大多數在酸性范圍內；分子量范圍從47kDa到199kDa，多為同源二聚體，部分為同源四聚體；比酶活范圍從5.4到140.27U/mg。

大腸桿菌表達系統是目前應用最為廣泛的外源蛋白表達系統，具有成本低、產量高、易放大等特點。雖然目前已有采用大腸桿菌表達系統進行ADI重組表達的相關文獻，例如劉詠梅等人的《精氨酸脫亞胺酶基因在大腸桿菌中的克隆、表達及純化》，但是現有文獻公開的方法其產量和活性基本還達不到產業化制備ADI的要求。

為了獲得更高的蛋白體積收率研究人員開發了高密度發酵方法，但在高密度發酵過程中由于菌體密度較高往往會導致發酵復合培養基成本高、DO控制困難等問題。針對這些問題，菌株構建、發酵過程的控制、發酵培養基的篩選就顯得尤為重要。

此外，使用大腸桿菌作為外源蛋白的表達宿主時，由于蛋白在大腸桿菌中的過表達、宿主自身匱乏的蛋白翻譯和修飾以及蛋白表達條件等多種因素導致過表達蛋白在大腸桿菌中以包涵體形式存在。蛋白的包涵體形式表達具有：表達量高、純度高、降低下游純化成本的特點。同時，一般而言包涵體是一種無活性的蛋白聚集體，需要進行人工復性才能獲得相應的生物學功能。而包涵體的復性是一個非常復雜的過程，不僅與蛋白質復性的過程控制密切相關，還很大程度上取決于目的蛋白的自身性質。如果復性條件不適宜將會出現分子間共價結合或疏水結合形成聚合體，降低重組蛋白的比活率，造成產品質量不合格，同時又易產生沉淀析出，影響得率。

發明內容

本專利要解決的3個技術層面的問題是：1、構建符合藥用蛋白要求的rADI大腸桿菌表達菌株，實現蛋白的高效表達；2、開發產量高、成本低廉、易于放大的rADI大腸桿菌菌株高密度發酵工藝；3、開發獲得純度高、活性好的rADI變復性及純化工藝。

本發明目的之一在于提供一種構建rADI的重組大腸桿菌表達菌株的方法，該方法包括：針對大腸桿菌表達系統的ADI基因密碼子優化、表達載體構建和表達菌株構建。具體來說就是：

本發明提供了一種rADI，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。