[發明專利]重組精氨酸脫亞胺酶及其產業化制備方法和應用

有效

• 申請號: 201711371748.2
• 申請日: 2017-12-19
• 公開（公告）號: CN108265068B
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: 馬永;趙百學;王俊
• 申請（專利權）人: 江蘇眾紅生物工程創藥研究院有限公司
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/78;C12N15/70;C12N1/21;A61K38/50;A61P35/00
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1.一種編碼精氨酸脫亞胺酶的基因，其堿基序列如SEQ ID NO:1所示。

2.含有權利要求1所述編碼精氨酸脫亞胺酶的基因的載體，所述的載體為pET21b或者pET28a。

3.包含權利要求2所述載體的大腸桿菌菌株，所述大腸桿菌菌株為BL21(DE3)、BL21(DE3)plys或Rosetta（DE3）。

4.一種精氨酸脫亞胺酶的重組制備方法，所述方法包含下述步驟：

將如權利要求3所述的大腸桿菌菌株的二級種子液按照5-15%的接種量接入到含滅菌后的分批發酵培養基發酵罐中，發酵接種之前加入1/1000（V/V）的微量元素母液；所述分批發酵培養基組成及含量：一水合檸檬酸0.5-3 g/L，磷酸二氫鉀8-15 g/L，磷酸氫二銨3-7g/L，葡萄糖10-20 g/L，七水合硫酸鎂1.5-3 g/L；所述微量元素母液組成及含量：FeSO₄.7H₂O 10 g/L、ZnSO₄.7H₂O 2.25 g/L、CuSO₄.5H₂O 15 g/L、MnSO₄.5H₂O 5 g/L、CaCl₂.7H₂O 1 g/L、CoCl.6H₂O 1 g/L、Na₂MoO₄.2H₂O 1.125 g/L、H₃BO₃ 0.0625 g/L、HCl41.75 mL、Biotin 0.5 g/L;

設定發酵溫度為37℃、pH為6.8-7.2之間、DO設定在35-40%之間；

發酵開始后定期取樣進行OD₆₀₀和菌體濕重的測定，待DO曲線出現急劇上升的時候，開始加入補料培養基進行補料培養，補料開始之前加入1/1000（V/V）的微量元素母液；所述補料培養基組成及含量：甘油1024g/L，七水合硫酸鎂10-20g/L；補料培養基的流加速度維持在25-30g/h;

待菌體生長至OD₆₀₀為45-55之間向發酵罐中加入終濃度為0.2-1.0mM/L的IPTG進行誘導表達；37℃誘導表達4-6h結束培養；

誘導表達培養結束后還包括精氨酸脫亞胺酶包涵體變性前預純化，包括如下步驟：（1）誘導表達結束后的菌體使用緩沖液Buffer A充分重懸至菌體濃度為100g/L，室溫攪拌1.5h；

離心破碎；（2）菌體破碎后收集的精氨酸脫亞胺酶包涵體固體顆粒分別使用bufferB、bufferC、去離子水重懸，離心收集包涵體沉淀，即得到預純化后的精氨酸脫亞胺酶包涵體；所述Buffer A組成及含量:50mM Tris-HCl，1mM EDTA，100mM 氯化鈉，1mM PMSF，0.5mg/ml溶菌酶，pH=8.0;所述bufferB組成及含量：20-100mM Tris-HCl， 0.5-5mM EDTA，100-300mMNaCl，1mM PMSF, 0.5-2% TritonX-100，pH=8.0；所述bufferC組成及含量：20-100mM Tris-HCl，0.5-5mM EDTA，0.1-0.3M NaCl，1mM PMSF，0.5-2% TritonX-100，1.5-4M脲，pH=8.0；

預純化結束后還包括精氨酸脫亞胺酶包涵體變性，變性液buffer D組成及含量：8-10M脲，20-50mM Tris-HCl，8-10mM DTT，0-1mM EDTA，pH 10.0；以及精氨酸脫亞胺酶包涵體復性，復性緩沖液buffer E組成及含量：8-12mM PB，0-1mM EDTA，0-10mM DTT，pH 7.2。

5.權利要求4所述的精氨酸脫亞胺酶的重組制備方法，還包括精氨酸脫亞胺酶包涵體復性后樣品的純化，所述純化方法是使用離子交換層析及疏水層析兩步純化法。