[發明專利]內切葡聚糖酶、其編碼基因cel5A-h31及其應用

有效

• 申請號: 201711369273.3
• 申請日: 2017-12-18
• 公開（公告）號: CN107937371B
• 公開（公告）日: 2019-06-11
• 發明（設計）人: 王佳堃;何波;金舒文;高歌;李嘉秋
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/11;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/14;C12R1/19
• 代理公司: 嘉興永航專利代理事務所(普通合伙) 33265
• 代理人: 侯蘭玉

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種新型內切葡聚糖酶、其編碼基因cel5A?h31及其應用。一種編碼所述內切葡聚糖酶的基因cel5A?h31，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。生物信息學分析表明，該基因編碼的內切葡聚糖酶屬于糖苷水解酶第5家族。發明人通過設計引物成功將其克隆，并在原核表達系統中成功表達，經誘導超聲純化所得的重組內切葡聚糖酶的最適作用pH為5.0，最適溫度為55°C，在50°C以下能保持相對穩定的酶活性，具有較強的pH耐受性，在pH5.0?9.0下能保持75%以上的酶活性。該重組內切葡聚糖酶具有較大的研究和工業應用潛力。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種新型內切葡聚糖酶、其編碼基因cel5A-h31及其應用。

背景技術

纖維素作為植物細胞壁的主要組成成分，是目前自然界中最豐富的可再生資源，然而其頑固的結構限制了它的利用。纖維素降解成葡萄糖的過程需要內切葡聚糖酶(endoglucanase，EC3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase，E.C.3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，E.C.3.2.1.21)三種纖維素酶的系統同作用。其中，內切葡聚糖酶是纖維素酶系最主要的成分，它主要作用于纖維素的非結晶區，隨機水解纖維素鏈中的β-1,4糖苷鍵，切斷纖維素長鏈，轉化為大量不同聚合度的短鏈，降低纖維素的聚合度，在降解過程中發揮關鍵的作用。因此，它的生產利用對于纖維素的降解效率至關重要。目前，該酶已經廣泛應用于造紙、紡織、食品、生物燃料、動物飼養等行業中。這些產業上的應用需要生產成本低，具有不同的最適pH和溫度，以及較好穩定性的內切葡聚糖酶。過去幾十年，大量的研究集中在如何減少真菌生產纖維素酶的成本，主要包括菌的隨機誘變、工業優化、外源蛋白添加等方法。然而，由于缺乏對復雜酶系和產酶菌的充分了解，這一進程相當緩慢。因此，尋找大量新型的內切葡聚糖酶尤為重要。

隨著組學的出現，一些產木質纖維素酶的微生物基因組測序陸續完成，為進一步的研究提供了清晰的遺傳背景，越來越多的纖維素酶基因核苷酸序列得以確定，并在大腸桿菌和酵母中得到了表達，有效地補充了傳統的酶系統。而轉錄組測序能夠提供基因cDNA序列和基因的表達水平，能夠真實反映蛋白在體內的表達情況，因此，從環境微生物轉錄組信息中發掘內切葡聚糖酶基因是比較新穎，同時也是行之有效的研究方向。

發明內容

本發明提供一種新型的內切葡聚糖酶基因cel5-h31，其原核表達后重組酶Cel5-H31為嗜中溫酶，50℃下能保持穩定的酶活性；最適反應溫度為55℃，最適pH為5.0；在pH5.0-9.0具有較強的耐受性，能保持較高酶活性。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種內切葡聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

一種編碼所述內切葡聚糖酶的內切葡聚糖酶基因cel5A-h31，其核苷酸序列如SEQID No.1所示。本發明內切葡聚糖酶基因cel5A-h31來自湖羊瘤胃微生物轉錄組數據。

一種包含所述內切葡聚糖酶基因cel5A-h31的重組載體。

一種包含所述木聚糖酶基因cel5A-h31的重組菌。

一種制備內切葡聚糖酶的方法，是發酵培養所述的重組菌，得到內切葡聚糖酶。

擴增所述內切葡聚糖酶基因cel5A-h31采用的特異性引物，其特征在于所述的特異性引物為：H31-F：5’ACAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGCAGCGTATCAAAATCTTAGCG 3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；H31-R：5’CTTGTCGACGGAGCTCGAATTCTTATGCCGCAGGCGCTTCC 3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。