[發(fā)明專利]一種SPE法提取循環(huán)腫瘤DNA的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711364691.3
• 申請(qǐng)日: 2017-12-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109929830B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-01-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梁鑫淼;李秀玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 沈陽(yáng)晨創(chuàng)科技專利代理有限責(zé)任公司 21001
• 代理人: 鄭虹

本發(fā)明提供一種SPE法提取循環(huán)腫瘤DNA的方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明具體步驟如下：1)將循環(huán)腫瘤DNA富集材料裝入移液槍槍頭或者凝膠上樣吸頭中，形成微固相萃取柱，采用洗脫液和上樣液活化及平衡微固相萃取柱，將生物樣品溶解于上樣液中，并上到微固相萃取柱上，循環(huán)腫瘤DNA富集材料與生物樣品的質(zhì)量比為100～1000:1；2)采用5?200倍柱體積的淋洗液沖洗萃取柱，淋洗液pH 0?7；3)采用5?100倍柱體積的洗脫液洗脫得循環(huán)腫瘤DNA，洗脫液pH 10?12；所述DNA富集材料為金屬內(nèi)核/碳?xì)咏Y(jié)構(gòu)的納米顆粒材料。所述DNA富集材料為金屬內(nèi)核/碳?xì)咏Y(jié)構(gòu)的納米顆粒。本發(fā)明的方法在提取循環(huán)腫瘤DNA方面表現(xiàn)出了高選擇性和高通量等特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤DNA的有效分離和富集。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種SPE法提取循環(huán)腫瘤DNA的方法。

背景技術(shù)

循環(huán)腫瘤DNA，即ctDNA(circulating tumor DNA)，是指腫瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)細(xì)胞凋亡或者壞死產(chǎn)生的DNA片段釋放進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。ctDNA存在于血液、滑膜液和腦脊液等體液中。由于ctDNA半衰期為1小時(shí)左右，能準(zhǔn)確反映腫瘤當(dāng)前情況，所以ctDNA可以作為組織活檢的非侵入性替代方案。另外，ctDNA在癌癥早期診斷、預(yù)后和測(cè)定藥物治療反應(yīng)中發(fā)揮作用。

目前主流的ctDNA突變檢測(cè)技術(shù)包括基于PCR擴(kuò)增技術(shù)和基于DNA序列檢測(cè)技術(shù)兩類。但是不管哪種測(cè)序技術(shù)，都需要都對(duì)DNA進(jìn)行富集和提取，以降低對(duì)擴(kuò)增或者后續(xù)測(cè)序的干擾。

ctDNA的主要提取方法主要是基于硅球、磁性小球的固相萃取方法和基于苯酚-氯仿的液液提取方法。主要問(wèn)題是提取效率和重新性。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種SPE法提取循環(huán)腫瘤DNA的方法。

一種SPE法提取循環(huán)腫瘤DNA的方法，采用分散固相萃取模式，具體步驟如下：

1)將循環(huán)腫瘤DNA富集材料裝入移液槍槍頭或者凝膠上樣吸頭中，形成微固相萃取柱，采用洗脫液和上樣液活化及平衡微固相萃取柱，將生物樣品溶解于上樣液中，并上到微固相萃取柱上，循環(huán)腫瘤DNA富集材料與生物樣品的質(zhì)量比為100～1000:1；

2)采用5-200倍柱體積的淋洗液沖洗萃取柱，淋洗液pH 0-7；

3)采用5-100倍柱體積的洗脫液洗脫得循環(huán)腫瘤DNA，洗脫液pH 10-12；

上述整個(gè)過(guò)程在10-60℃進(jìn)行；

所述循環(huán)腫瘤DNA富集材料為金屬內(nèi)核/碳?xì)咏Y(jié)構(gòu)的納米顆粒材料。

所述金屬內(nèi)核/碳?xì)咏Y(jié)構(gòu)的納米顆粒材料，其內(nèi)核為金屬納米顆粒，其外殼的結(jié)構(gòu)式為如下所示：

所述金屬為Ag,Ti,Fe,Ga,Ni,Au,Pd或Pt。。

所述生物樣品為血液、滑膜液、腦脊液或尿液。

所述上樣液為有機(jī)溶劑、有機(jī)酸和水的混合液，有機(jī)溶劑為乙腈、甲醇或乙醇；有機(jī)酸為甲酸、乙酸或三氟乙酸，所述上樣液中有機(jī)溶劑體積為10-50％，pH 0-7。

所述洗脫液為有機(jī)溶劑、有機(jī)酸和水的混合液，有機(jī)溶劑為乙腈、甲醇或乙醇；有機(jī)酸為甲酸、乙酸或三氟乙酸，所述洗脫液中有機(jī)溶劑體積為10-50％，pH 10-12。

所述淋洗液為有機(jī)溶劑、有機(jī)酸和水的混合液，有機(jī)溶劑為乙腈、甲醇或乙醇；有機(jī)酸為甲酸、乙酸或三氟乙酸，所述淋洗液中有機(jī)溶劑的體積為0-50％，pH 0-7。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為：本發(fā)明的方法在提取循環(huán)腫瘤DNA方面表現(xiàn)出了高選擇性和高通量等特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤DNA的有效分離和富集。

附圖說(shuō)明