[發明專利]縊蟶溶菌酶基因、編碼蛋白及重組縊蟶溶菌酶基因工程菌的構建方法和應用

有效

• 申請號: 201711363539.3
• 申請日: 2017-12-18
• 公開（公告）號: CN108251440B
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 邵銥娜;李成華;魏智薪;張衛衛;趙雪琳;蔣麗婷
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/36;C12N15/70;C12N1/21;A61K38/47;A61P31/04
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理有限公司 33226
• 代理人: 何仲

1.一種縊蟶溶菌酶基因，其特征在于該基因為SEQ ID NO.1所示的cDNA序列。

2.一種權利要求1所述的縊蟶溶菌酶基因的克隆方法，其特征在于具體步驟如下：

a.總RNA提取：取縊蟶鰓組織制備得到RNA提取液；

b.cDNA第一鏈合成：將RNA提取液用cDNA合成試劑盒逆轉錄合成cDNA；

c.PCR擴增：cDNA 1.0μL，含Mg²⁺的10×PCR緩沖液2.5μL，濃度2.5mM的dNTP 2.0μL，濃度10μM的Lysozyme上游擴增引物1.0μL，濃度10μM的Lysozyme下游擴增引物1.0μL，濃度5U/μL的DNA聚合酶0.2μL，超純水17.3μL；擴增條件：94℃5min、94℃30s、60℃30s、72℃1min，共35個循環，最后72℃延伸10min；其中Lysozyme上游擴增引物：

ATGCTCCTTTACGCTGTGGTCAT，Lysozyme下游擴增引物：

CTAATGGACATTAGAACATCCTG；

d.PCR陽性克隆質粒：擴增反應后，用膠回收試劑盒回收PCR產物，然后回收產物與載體pMD19-T連接，轉化至大腸桿菌Escherichia coli DH5α后，在含有氨芐濃度為50μg/mL的LB平板培養基中培養8-12h，挑取陽性克隆菌落，進行PCR驗證，并送至上海生工生物工程有限公司測序鑒定，得到正確的PCR陽性克隆質粒，即縊蟶溶菌酶基因，該基因具有SEQ ID NO.1所示的cDNA序列。

3.一種根據權利要求1所述的縊蟶溶菌酶基因編碼蛋白，其特征在于：該編碼蛋白為SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

4.根據權利要求3所述的縊蟶溶菌酶基因編碼蛋白，其特征在于：該編碼蛋白的成熟肽為SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

5.一種利用權利要求4所述的縊蟶溶菌酶基因編碼蛋白構建重組縊蟶溶菌酶基因工程菌的方法，其特征在于步驟如下：

(1)設計PCR引物，用分別含有BamHI位點和XhoI位點的引物擴增縊蟶溶菌酶基因編碼蛋白的基因；

(2)將克隆得到的目的基因插入pET28a(+)載體，獲得重組質粒pET28a(+)-Lysozyme；

(3)對重組質粒pET28a(+)-Lysozyme進行誘導表達，獲得重組縊蟶溶菌酶基因工程菌。