[發明專利]縊蟶溶菌酶基因、編碼蛋白及重組縊蟶溶菌酶基因工程菌的構建方法和應用

有效

• 申請號: 201711363539.3
• 申請日: 2017-12-18
• 公開（公告）號: CN108251440B
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 邵銥娜;李成華;魏智薪;張衛衛;趙雪琳;蔣麗婷
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/36;C12N15/70;C12N1/21;A61K38/47;A61P31/04
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理有限公司 33226
• 代理人: 何仲

本發明公開了縊蟶溶菌酶基因、編碼蛋白及重組縊蟶溶菌酶基因工程菌構建方法和應用，特點是縊蟶溶菌酶基因序列如SEQIDNO.1所示；縊蟶溶菌酶基因編碼蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；其重組縊蟶溶菌酶基因工程菌構建方法為用分別含有BamHI位點和XhoI位點的引物擴增縊蟶溶菌酶基因編碼蛋白的成熟肽序列；將克隆得到的目的基因插入pET28a（+）載體，獲得重組質粒pET28a（+）?Lysozyme；對重組質粒pET28a（+）?Lysozyme進行誘導表達，獲得重組縊蟶溶菌酶基因工程菌，優點是其表達的重組縊蟶溶菌酶基因工程菌對哈維氏弧菌，副溶血弧菌，燦爛弧菌均具有明顯的殺菌作用。

技術領域

本發明屬于分子生物學以及基因工程技術領域，尤其是涉及一種縊蟶溶菌酶基因、編碼蛋白及重組縊蟶溶菌酶基因工程菌的構建方法和應用。

背景技術

溶菌酶（Lysozyme，EC 3.2.1.17）是一種具有水解粘多糖功能的堿性酶，它能催化細菌細胞壁中粘多糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1，4糖苷鍵的水解，進而破壞細菌細胞壁肽聚糖支架、導致內容物逸出，從而引起細菌死亡。溶菌酶作為一種廣譜抗菌效應分子，廣泛存在于各種微生物、植物、無脊椎動物和脊椎動物中，并在生物機體的免疫防御系統中發揮重要作用。在無脊椎動物組織中分布最為廣泛的抗菌蛋白即是溶菌酶，這對只有先天免疫的無脊椎動物而言，溶菌酶的抗菌效應更為重要。在無脊椎動物中，溶菌酶還具有消化酶的作用，其通過分解微生物來獲得生長所需的部分碳源和氮源。隨著研究的深入，研究者發現溶菌酶除抗菌活性外，還具有許多其它功能，包括抗病毒、抗炎、抗腫瘤活性，以及誘導調節機體其他免疫因子的合成與分泌、協同其它免疫因子進行免疫防御調節作用。

溶菌酶獨特的作用機制和廣泛的抗菌作用，使其在臨床研究及大規模的市場應用上受到了越來越廣泛的關注。在醫學上，溶菌酶可以作為多種疾病的標志物，通過測定尿液、分泌物、血清或組織中溶菌酶的濃度和活性變化，作為診斷的指標之一。根據溶菌酶能溶菌，但對組織無刺激、無毒性的特性，己廣泛應用于食品、醫藥、化工、生物工程等領域。目前，人們對動物性食品安全的要求越來越高，溶菌酶作為天然、安全的抗菌物質也越來越廣泛的應用于畜禽及水產動物飼料中。隨著對水產動物免疫抗病機制研究的不斷深入，將重組溶菌酶作為綠色制劑應用到水產養殖中有望成為水產動物健康養殖的一條新途徑。

縊蟶（Sinonovacula constricta）作為我國四大養殖貝類之一，在水產養殖中占據了重要的經濟地位。然而，隨著沿海城市經濟的發展，海洋污染日益加劇，導致養殖縊蟶病害問題時有發生，尤其是細菌性疾病引發的疾病嚴重制約了縊蟶的生存和生長。目前在縊蟶養殖中大多使用抗生素進行防治，但抗生素的大量使用導致了“超級細菌”的出現以及抗生素的殘留引起的食品安全問題日益突出，人們迫切需要開發新型抗菌劑進行防治。溶菌酶作為一種天然殺菌蛋白，不會導致細菌耐藥性問題、而且對人體無毒害作用。因此，構建縊蟶溶菌酶基因表達工程菌，進而產業化制備綠色疾病制劑應用于水產養殖迫在眉睫。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種縊蟶溶菌酶基因、編碼蛋白及重組縊蟶溶菌酶基因工程菌的構建方法和應用，其表達的重組縊蟶溶菌酶基因工程菌對哈維氏弧菌，副溶血弧菌，燦爛弧菌均具有明顯的殺菌作用。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：

1、一種縊蟶溶菌酶基因，該基因具有SEQIDNO.1所示的cDNA序列。該序列全長768bp，包括423 bp的開放閱讀框，編碼140個氨基酸，5’非編碼區長168 bp，3’非編碼區長177bp，具有多聚腺苷酸信號(AATAAA)及序列末端含有典型的polyA尾。

所述的縊蟶溶菌酶基因的克隆方法，具體步驟如下：

a．總RNA提取：取縊蟶鰓組織制備得到RNA提取液；