[發明專利]一個插入內含子修飾的大豆氨基酸轉運蛋白融合基因及其應用

在審

• 申請號: 201711363075.6
• 申請日: 2017-12-18
• 公開（公告）號: CN108103087A
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發明（設計）人: 王寧寧;劉生;王丹;夏銅梅;徐偉
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/82;C12N15/11;A01H5/00;A01H6/54;A01H6/20
• 代理公司: 天津耀達律師事務所 12223
• 代理人: 侯力

一個插入內含子修飾的大豆氨基酸轉運蛋白基因及其應用。本發明在一個農桿菌致死的大豆氨基酸轉運蛋白編碼序列中插入一段內含子序列，人工拼接成一個融合基因，命名為NKNUE1，序列如SEQ ID No.1所示。NKNUE1可在植物細胞中正常表達，經內含子剪切后翻譯成廣譜氨基酸轉運蛋白；而農桿菌中缺乏相應內含子剪切機制，由此實現利用農桿菌介導的遺傳轉化獲得NKNUE1轉基因植物的目的。可以構建由35S啟動子或其他啟動子驅動NKNUE1表達載體并轉化目標植物。本發明提供兩個實施例，證明NKNUE1顯著增強轉基因大豆等對氨基酸的吸收和由源向庫輸送能力、低氮抗性增強、種子中總氮和重要氨基酸含量顯著增加。

【技術領域】：

本發明屬于植物基因工程領域，具體說是用分子生物學技術獲得一個插入內含子修飾的大豆氨基酸轉運蛋白編碼基因及其在轉基因植物/作物新品種培育中的應用。

【背景技術】：

氮素是植物生長所必需的重要元素之一，氮素的供應直接影響著農作物的品質和產量。氮肥是作物氮素供應的直接來源，然而氮肥的過度施用不僅對作物產量的貢獻極為有限，還會產生能源浪費和環境污染等諸多問題(巨曉棠等，2014a，2014b)。因此，提高植物對氮素的利用效率(nitrogen use efficiency，NUE)對農業的可持續發展有著重要意義。培育高效利用氮素營養的作物品種的途徑包括利用經典遺傳學方法選育優異的營養高效品種和利用現代分子生物學方法培育轉基因新材料。傳統選育方法周期長，見效慢；相比之下，轉基因技術更直接而快速。因此，利用基因工程技術，改造農作物對土壤中養分的吸收和轉運能力以及利用效率已經成為新世紀國際上農業科學研究的焦點課題。

植物對氮素的利用通過吸收、同化、轉運和再動員幾個步驟來完成(Masclaux-Daubresse等，2010)。土壤中的氨基酸可以直接被植物根系吸收，同時，對大多數植物來講，氨基酸還是其氮素轉運的主要形式(Tegeder，2014)。植物中吸收、合成或源器官中大分子降解所產生的氨基酸，其跨膜運輸是由氨基酸轉運蛋白來完成的。氨基酸轉運蛋白是一類膜蛋白，在真菌、動物和植物的細胞及細胞器之間的氨基酸運輸過程中發揮重要的功能(Wipf等，2002)。植物中的氨基酸轉運蛋白在植物根部從土壤中吸收的氨基酸、根部吸收和合成的氨基酸向生長的“庫”的長距離運輸、氮素再動員中“源”器官中氨基酸的韌皮部裝載、種子發育過程中氨基酸輸入等過程中均發揮著重要的功能(Hirner等，1998，2006；Hammes等，2006；Tegeder，2014；Lee等，2007；Sanders等，2009；Zhang等，2010)。

研究表明，高表達部分氨基酸轉運蛋白編碼基因可以賦予轉基因植物更好的生長發育狀態和產量相關性狀。在擬南芥中過表達AtLHT1可以增強轉基因植物對多種氨基酸的吸收功能，同時增加轉基因植物的生物量的積累(Hinier等，2006)；在豌豆中表達菜豆的AAP1基因顯著提高了轉基因豌豆種子中總氮和蛋白質的含量，增加了種子的重量(Rolletschek等，2005)；在番茄果實中過表達SlCAT9可以改善果實中氨基酸的組成(Snowden等，2015)。由此可以看出，對氨基酸轉運蛋白基因表達水平的調控對作物產量和品質的改善和提高具有重要意義。

大豆是全世界范圍廣泛栽培的主要農作物之一，也是我國重要的油料作物和高蛋白糧飼兼用作物，同時又是我國供需矛盾最為突出的農產品。大豆是需肥較多的作物，其生長所需的氮素只有三分之一來自固氮，另外三分之二要來自土壤和肥料。氮素既是提高大豆植株光合效率的保障，又是種子干物質積累和成熟的限制因子之一，因此，分離大豆中氨基酸轉運蛋白編碼基因用于作物氮素利用能力的提高和產量性狀的改善具有重要的應用價值，但是目前尚無相關的研究報道。

【發明內容】：