[發明專利]一個插入內含子修飾的大豆氨基酸轉運蛋白融合基因及其應用

在審

• 申請號: 201711363075.6
• 申請日: 2017-12-18
• 公開（公告）號: CN108103087A
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發明（設計）人: 王寧寧;劉生;王丹;夏銅梅;徐偉
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/82;C12N15/11;A01H5/00;A01H6/54;A01H6/20
• 代理公司: 天津耀達律師事務所 12223
• 代理人: 侯力

1.一個插入內含子修飾的大豆氨基酸轉運蛋白融合基因NKNUE1，其核酸序列選自：

(a)如序列表1所示的核酸序列；

(b)在(a)限定的核酸序列中至少具有85％以上的同源性的核酸序列。

2.構建權利要求1所述的融合基因NKNUE1的引物，其特征在于，設計用于融合基因NKNUE1創制的引物4條，具體引物序列如下，其中引物1中引入了Apa I酶切位點；引物4中引入了Spe I酶切位點：

引物1：5’-GGGCCCAGGATCCATGGGAAGCATGCACATAGAAACC-3’

引物2：5’-TCGCTTGCCATGTACAGGGTCA-3’

引物3：5’-TGACCCTGTACATGGCAAGCGA-3’

引物4：5’-ATACAAGCCCTTCCAAGCAGAACAACTCGAGGTACTAGT-3’。

3.構建權利要求1所述的融合基因NKNUE1的方法，其特征在于，具體操作步驟如下：

(1)利用權利要求2設計的引物1和引物2，以大豆基因組DNA為模板，用PCR擴增方法獲得片段A；利用權利要求2設計的引物3和引物4，以大豆cDNA為模板，用PCR擴增方法獲得片段B；

(2)分別回收A、B片段的PCR擴增產物；

(3)取(2)步回收的等量的A、B片段進行融合PCR；

(4)回收融合PCR產物；

(5)將上述(4)步回收的擴增產物，與pMD-18T載體在連接酶催化下進行連接反應；

(6)將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞；

(7)通過抗性篩選，獲得該融合基因NKNUE1的陽性TA克隆。

4.一種權利要求1所述的插入內含子修飾的大豆氨基酸轉運蛋白的融合基因NKNUE1的應用，其特征在于，利用獲得的融合基因NKNUE1，構建獲得由CaMV35S啟動子或其他啟動子驅動該融合基因表達的雙元表達載體，進行受體植物的遺傳轉化，從而獲得基因組中含有可在受體植物中組成型或特異性高表達含有以上所述核酸序列基因的轉基因植株。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，將CaMV35S啟動子驅動所述融合基因NKNUE1表達的雙元表達載體轉化模式植物擬南芥，獲得了低氮耐受性提高的轉基因擬南芥。

6.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，將CaMV35S啟動子驅動所述融合基因NKNUE1表達的雙元表達載體轉化大豆，獲得了該融合基因高表達的轉基因大豆，這些轉基因大豆植株中氨基酸的吸收和由“源”向“庫”的運輸能力增強，對低氮脅迫的耐受性得到顯著提高，而且無論足氮還是低氮培養條件下，高表達NKNUE1的轉基因大豆種子中總氮和多種游離氨基酸的含量都明顯提高，種子品質得到改善。