[發(fā)明專利]昆蟲細胞表達PSP為校準品的檢測PSP試劑盒

有效

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• 申請日: 2018-03-05
• 公開（公告）號: CN108181472B
• 公開（公告）日: 2020-07-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張蕾;李寶民;劉斌;王珺楠;史永豐;王賀;王玉華;隋寶真;趙青;劉思言;張金玲;黃景林;關(guān)恒;林林;朱道林;仇淑園;孫玉峰;張超
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué);長春恒曉生物科技有限責(zé)任公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569;G01N33/558;G01N33/96;C07K14/47;C12N15/12;C12N15/866
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責(zé)任公司 22100
• 代理人: 白冬冬

1.一種昆蟲細胞表達PSP為校準品的檢測PSP試劑盒，其特征在于：

1.①提取胃癌細胞細胞 RNA，合成cDNA基因庫，

②用PCR擴增出PSP DNA，核酸序列66-501，

③構(gòu)建pFastBac-Flag-PSP載體，

④此載體 DNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)到DH10Bac 細菌中，產(chǎn)生重組Flag-PSP AcNPV 質(zhì)粒，

⑤再把步驟④重組質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)進到SF9細胞，產(chǎn)生重組Flag-PSP AcNPV；

⑥重組Flag-PSP AcNPV感染SF9細胞并表達出帶有8個氨基酸殘基短肽和PSPFlag-PSP融合蛋白，用Anti-Flag M2 affinity agarose純化出具有自然蛋白抗原性Flag-PSP，作為PSP校準品；

2.建立檢測PSP側(cè)向免疫層析法試劑條，包括卡殼和試紙條；卡殼為試紙條外部殼結(jié)構(gòu)，由底座和卡蓋構(gòu)成，卡蓋上設(shè)置有加樣窗口和觀察窗口；

3.側(cè)向免疫層析試紙條由底板及附著于底板上依次相互交錯排列的樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙構(gòu)成；結(jié)合墊上噴涂羊抗PSP抗體-銪螯合物熒光微粒；硝酸纖維素膜上噴涂PSP抗體形成檢測線，兔抗羊IgG 抗體形成質(zhì)控線，其中，檢測線固定PSP抗體與結(jié)合墊上PSP抗體識別不同的PSP抗原表位；

4.把樣品墊浸泡在樣品墊處理液中，室溫條件下，2-4小時，36-38°C，烘干6-12小時，加入干燥劑封存?zhèn)溆茫话呀Y(jié)合墊浸泡在結(jié)合墊處理液中，室溫條件下，2-4小時，36-38°C，烘干6-12小時，加入干燥劑封存?zhèn)溆茫?/p>

5.用抗體凈化和濃縮離心柱，凈化和濃縮羊抗PSP抗體；選用銪螯合物，熒光標記羧基修飾微球,直徑為100-300nmn，用2-20mmol碳二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺處理銪螯合物羧基修飾微球后，把0.5-2.0mg/ml羊抗PSP抗體偶聯(lián)到銪螯合物微球上，PSP抗體與銪螯合物微球重量比為1：50-5：50，用噴膜儀以5ul-15ul/cm 速度將微球噴涂于結(jié)合墊上，在35-37°C，烘干1-4小時，加入干燥劑封存?zhèn)溆茫?/p>

6.用抗體凈化和濃縮離心柱，把PSP單克隆抗體和兔抗羊IgG抗體凈化后，用包被液把兩抗體濃度調(diào)到0.5-2.0mg/ml；用定量噴膜儀以0.8-1.5ul/cm速度，將兩抗體以4-6mm間隔噴涂硝酸纖維素膜上，形成檢測線和質(zhì)控線，其中，檢測線距離結(jié)合墊邊緣為6-12mm，35-37°C，烘干1-4小時，加入干燥劑封存?zhèn)溆茫?/p>

7.底板上中間鋪放硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜質(zhì)控線一側(cè)鋪放吸水紙，吸水紙位于硝酸纖維素膜上方，吸水紙與硝酸纖維素膜相重疊長度為1.8mm-2.2mm；硝酸纖維素膜檢測線一端鋪放結(jié)合墊，結(jié)合墊位于硝酸纖維素膜上方，結(jié)合墊與硝酸纖維素膜相重疊長度為1.8mm-2.2mm；結(jié)合墊另一端鋪設(shè)樣品墊，樣品墊位于結(jié)合墊上方，樣品墊與結(jié)合墊相重疊長度為3mm-4mm；最后切割成寬度為5mm試紙條，將試紙條裝入塑料卡殼里，組裝成檢測試紙條；

8.銪螯合物微球上熒光染料為銪螯合物，激發(fā)波長310-380nm,檢測波長610-670nm，其中，發(fā)射熒光在延時后再測量熒光強度,建立時間分辨熒光法測定試紙條上熒光強度；

9.Flag-PSP作為校準品，用TRFIA檢測儀測定不同濃度PSP校準品試紙條檢測線上呈現(xiàn)熒光強度，建立PSP濃度標準曲線，獲得PSP濃度標準卡，輸入TRFIA檢測儀，建立自動顯示待測樣品中PSP濃度的運行系統(tǒng)；

10.抗體稀釋液：0.5-2% BSA, 2-10% Sucrose，0.02-0.1% Tween-20，0.4-1.0%Trehalose，0.02-0.1% NaN3,100-300mmol NaCl, 20-50mmol磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液pH7.0-7.5，

包被液：0.2-1.0% Trehalose，1-5% Sucrose，0.02-0.1% Tween-20，0.05-0.1% NaN3,100-300mmolNaCl, 20-50mmol磷酸鹽緩沖液

樣品墊處理液：0.2-1.0%BSA，0.05-0.2% Tween-20，0.05-0.2% NaN3,100-300mmolNaCl, 20-50mmol磷酸鹽緩沖液

結(jié)合墊處理液：0.05-0.2% Tween-20，0.05-0.2% NaN3,100-300mmolNaCl, 20-50mmol磷酸鹽緩沖液

樣品稀釋液：1-5% BSA,0.02-0.1% Tween-20，0.02-0.1% NaN3,100-200mmol NaCl,20-50mmolTris。