[發(fā)明專利]昆蟲細(xì)胞表達(dá)sST2做為測定血清中sST2濃度的校準(zhǔn)品

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711358221.6
• 申請日: 2017-12-17
• 公開（公告）號(hào): CN108106894B
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王珺楠;李寶民;杜培革;劉斌;關(guān)大偉;趙雪;應(yīng)瑛;隋寶真;王玉華;史永峰;王賀;關(guān)恒;安麗萍;苑廣信;王曼力;林林;張繼海
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué);長春恒曉生物科技有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): G01N1/28
• 分類號(hào): G01N1/28;G01N33/68
• 代理公司: 吉林長春新紀(jì)元專利代理有限責(zé)任公司 22100
• 代理人: 白冬冬

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。公開了用昆蟲細(xì)胞表達(dá)可溶性生長刺激表達(dá)蛋白2做為ELISA測定血清中sST2濃度的校準(zhǔn)品過程，此方法步驟如下：提取T47D細(xì)胞RNA,用于合成cDNA，用PCR擴(kuò)增出sST2DNA；用sST2 DNA構(gòu)成pFastBac?Flag?sST2載體，再轉(zhuǎn)導(dǎo)入HD10Bac細(xì)菌株，產(chǎn)生重組Flag?sST2昆蟲病毒質(zhì)粒；把Flag?sST2AcNPV質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)昆蟲細(xì)胞，產(chǎn)生重組Flag?sSt2AcNPV；用Flag?sST2 AcNPV感染SF9細(xì)胞，表達(dá)出Flag?sST2蛋白，用Anti?Flag M2 affinity agarose純化出具有自然結(jié)構(gòu)和抗原性Flag?sST2；用Flag?sST2作為校準(zhǔn)品，建立雙夾心酶聯(lián)免疫法，測定血清或其它液體中sST2濃度,此發(fā)明制備出具有蛋白自然結(jié)構(gòu)和抗原性Flag?sST2，做為測定液體中sST2濃度的校準(zhǔn)品，用于臨床檢測血清中sST2濃度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

可溶性生長刺激表達(dá)蛋白2(Soluble suppression of tumorigenicity 2 ，sST2)屬于白介素-1受體家族成員。ST2基因表達(dá)于肥大細(xì)胞、輔助性Ｔ細(xì)胞２（Ｔｈ２）、成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞等。在人體內(nèi)ST2基因編碼3種亞型蛋白質(zhì), 一是在人腸組織中表達(dá)的ST2V。二是膜結(jié)合型受體蛋白ST2L，由細(xì)胞膜外3個(gè)串聯(lián)的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)的TIR(Toll/Interleukin-lreceptor)結(jié)構(gòu)域三部分組成。ST2L 選擇性表達(dá)在Th2淋巴細(xì)胞表面，可作為 Th2細(xì)胞表面標(biāo)記分子。ST2L可與細(xì)胞外配體分子白介素-33(IL-33)及細(xì)胞膜上的白介素-1受體輔助蛋白形成復(fù)合物，激活細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路，促進(jìn)Th2相關(guān)的炎癥因子（IL-4, IL-5, IL-13）表達(dá)，參與多種免疫相關(guān)疾病的調(diào)控過程。ST2基因編碼第三種蛋白為sST2，與ST2L比較，sST2缺少ST2L跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，在C-末端存在5個(gè)不同的氨基酸片段，為分泌性，可溶型蛋白（sST2），分泌到細(xì)胞外血液中，sST2在心力衰竭發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用。

研究表明，IL-33通過與心肌細(xì)胞膜ST2L結(jié)合，具有抗心肌細(xì)胞肥大、抗心肌纖維化等作用。當(dāng)心肌肥大和衰竭時(shí)，心肌成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，在受到機(jī)械牽拉刺激后，釋放出IL-33增多；與此同時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞也釋放更多sST2到血液中。sST2可作為誘騙受體，能夠競爭性結(jié)合血液中游離IL-33，從而抑制血液中IL-33結(jié)合到心肌細(xì)胞膜上ST2L受體，削弱IL-33 抗心肌肥大和纖維化作用，加重心力衰竭。由此看出，血液中sST2濃度增高代表心力衰竭發(fā)生。

測定病人血清中sST2濃度，作為心力衰竭新型標(biāo)志物，用于判定心力衰竭的發(fā)生和愈后。需要開發(fā)出測定血清中sST2濃度的免疫學(xué)方法試劑盒，同時(shí)需要純化sST2做為試劑盒的校準(zhǔn)品。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的采用昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)sST2，可用于診斷心力衰竭昆蟲細(xì)胞表達(dá)sST2做為測定血清中sST2濃度的校準(zhǔn)品。

本發(fā)明步驟是：

a、提取T47D RNA，合成T47D cDNA基因庫，用PCR擴(kuò)增出sST2 DNA，核酸序列55-987，構(gòu)建pFastBac-Flag-sST2載體；

b、pFastBac-Flag-sST2載體 DNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)到HD10Bac 細(xì)菌中，產(chǎn)生重組Flag-sST2AcNPV 質(zhì)粒；

c、重組Flag-sST2 AcNPV質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)到SF9細(xì)胞，產(chǎn)生重組Flag-sST2 AcNPV；

d、重組Flag-sST2 AcNPV感染SF9細(xì)胞并表達(dá)出帶有8個(gè)氨基酸殘基-----DYKDDDDK，短肽Flag，sST2-----19-328氨基酸殘基的Flag-sST2蛋白；