[發明專利]昆蟲細胞表達sST2做為測定血清中sST2濃度的校準品

有效

• 申請號: 201711358221.6
• 申請日: 2017-12-17
• 公開（公告）號: CN108106894B
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發明（設計）人: 王珺楠;李寶民;杜培革;劉斌;關大偉;趙雪;應瑛;隋寶真;王玉華;史永峰;王賀;關恒;安麗萍;苑廣信;王曼力;林林;張繼海
• 申請（專利權）人: 吉林大學;長春恒曉生物科技有限責任公司
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N33/68
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 白冬冬

本發明屬于生物技術領域。公開了用昆蟲細胞表達可溶性生長刺激表達蛋白2做為ELISA測定血清中sST2濃度的校準品過程，此方法步驟如下：提取T47D細胞RNA,用于合成cDNA，用PCR擴增出sST2DNA；用sST2 DNA構成pFastBac?Flag?sST2載體，再轉導入HD10Bac細菌株，產生重組Flag?sST2昆蟲病毒質粒；把Flag?sST2AcNPV質粒DNA轉導進昆蟲細胞，產生重組Flag?sSt2AcNPV；用Flag?sST2 AcNPV感染SF9細胞，表達出Flag?sST2蛋白，用Anti?Flag M2 affinity agarose純化出具有自然結構和抗原性Flag?sST2；用Flag?sST2作為校準品，建立雙夾心酶聯免疫法，測定血清或其它液體中sST2濃度,此發明制備出具有蛋白自然結構和抗原性Flag?sST2，做為測定液體中sST2濃度的校準品，用于臨床檢測血清中sST2濃度。

技術領域

本發明屬于生物技術領域。

背景技術

可溶性生長刺激表達蛋白2(Soluble suppression of tumorigenicity 2 ，sST2)屬于白介素-1受體家族成員。ST2基因表達于肥大細胞、輔助性Ｔ細胞２（Ｔｈ２）、成纖維細胞、心肌細胞等。在人體內ST2基因編碼3種亞型蛋白質, 一是在人腸組織中表達的ST2V。二是膜結合型受體蛋白ST2L，由細胞膜外3個串聯的免疫球蛋白結構域、跨膜結構域和細胞內的TIR(Toll/Interleukin-lreceptor)結構域三部分組成。ST2L 選擇性表達在Th2淋巴細胞表面，可作為 Th2細胞表面標記分子。ST2L可與細胞外配體分子白介素-33(IL-33)及細胞膜上的白介素-1受體輔助蛋白形成復合物，激活細胞內多條信號通路，促進Th2相關的炎癥因子（IL-4, IL-5, IL-13）表達，參與多種免疫相關疾病的調控過程。ST2基因編碼第三種蛋白為sST2，與ST2L比較，sST2缺少ST2L跨膜結構域和胞內結構域，在C-末端存在5個不同的氨基酸片段，為分泌性，可溶型蛋白（sST2），分泌到細胞外血液中，sST2在心力衰竭發生和發展過程中起重要作用。

研究表明，IL-33通過與心肌細胞膜ST2L結合，具有抗心肌細胞肥大、抗心肌纖維化等作用。當心肌肥大和衰竭時，心肌成纖維細胞和血管內皮細胞，在受到機械牽拉刺激后，釋放出IL-33增多；與此同時，血管內皮細胞，成纖維細胞和心肌細胞也釋放更多sST2到血液中。sST2可作為誘騙受體，能夠競爭性結合血液中游離IL-33，從而抑制血液中IL-33結合到心肌細胞膜上ST2L受體，削弱IL-33 抗心肌肥大和纖維化作用，加重心力衰竭。由此看出，血液中sST2濃度增高代表心力衰竭發生。

測定病人血清中sST2濃度，作為心力衰竭新型標志物，用于判定心力衰竭的發生和愈后。需要開發出測定血清中sST2濃度的免疫學方法試劑盒，同時需要純化sST2做為試劑盒的校準品。

發明內容

本發明的目的采用昆蟲細胞系統表達sST2，可用于診斷心力衰竭昆蟲細胞表達sST2做為測定血清中sST2濃度的校準品。

本發明步驟是：

a、提取T47D RNA，合成T47D cDNA基因庫，用PCR擴增出sST2 DNA，核酸序列55-987，構建pFastBac-Flag-sST2載體；

b、pFastBac-Flag-sST2載體 DNA 轉導到HD10Bac 細菌中，產生重組Flag-sST2AcNPV 質粒；

c、重組Flag-sST2 AcNPV質粒DNA 轉導進到SF9細胞，產生重組Flag-sST2 AcNPV；

d、重組Flag-sST2 AcNPV感染SF9細胞并表達出帶有8個氨基酸殘基-----DYKDDDDK，短肽Flag，sST2-----19-328氨基酸殘基的Flag-sST2蛋白；