[發明專利]昆蟲細胞表達sST2做為測定血清中sST2濃度的校準品有效
| 申請號： | 201711358221.6 | 申請日： | 2017-12-17 |
| 公開（公告）號： | CN108106894B | 公開（公告）日： | 2020-09-08 |
| 發明（設計）人： | 王珺楠;李寶民;杜培革;劉斌;關大偉;趙雪;應瑛;隋寶真;王玉華;史永峰;王賀;關恒;安麗萍;苑廣信;王曼力;林林;張繼海 | 申請（專利權）人： | 吉林大學;長春恒曉生物科技有限責任公司 |
| 主分類號： | G01N1/28 | 分類號： | G01N1/28;G01N33/68 |
| 代理公司： | 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100 | 代理人： | 白冬冬 |
| 地址： | 130012 吉*** | 國省代碼： | 吉林;22 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 昆蟲 細胞 表達 sst2 做為 測定 血清 濃度 校準 | ||
1.一種昆蟲細胞表達sST2作為測定血清中sST2濃度的校準品的方法，其特征在于：其步驟是：
a、提取T47D細胞RNA，合成T47D細胞cDNA基因庫，用PCR擴增出sST2 DNA，sST2DNA的核酸序列55-987，構建pFastBac-Flag-sST2載體；
b、pFastBac-Flag-sST2載體DNA轉導到HD10Bac細菌中，產生重組Flag-sST2AcNPV質粒；
c、重組Flag-sST2 AcNPV質粒DNA轉導進到SF9細胞，產生重組Flag-sST2 AcNPV；
d、重組Flag-sST2 AcNPV感染SF9細胞并表達出帶有8個氨基酸殘基DYKDDDDK、短肽Flag、sST2的19-328氨基酸殘基的Flag-sST2蛋白；
e、用Anti-Flag M2親和瓊脂糖純化出具有蛋白自然結構和抗原性Flag-sST2蛋白；
用Flag-sST2作為校準品，建立雙夾心酶聯免疫法，測定血清或其它體液中sST2濃度；
上述合成cDNA和PCR擴增sST2 DNA：
(1)合成cDNA用隨機引物法
放在0.5ml微量離心管中,混勻；放置在65℃條件下，5分鐘，放在冰塊中5分鐘；
(2)離心后，加下列物質到上述0.5ml微量離心管中
(3)混勻，離心后，放置在50℃條件下，反應10分鐘；
(4)放置在80℃條件下，滅活10分鐘；
(5)加1ul E.coilRNaseH，37℃條件下，反應20分鐘，獲得cDNA；
(6)合成引物，引物-1，5’-tttttcatatgaagtttagtaaacaatcatggg-3’
引物-2，5’-tttttctcgagtcagaaacactccttacttggatt-3’；
(7)進行PCR
(8)PCR條件如下：
重復B-D步驟30次
E.95℃ 1分鐘30秒
F.56℃ 1分鐘30秒
G.72℃ 6分鐘
冷卻到25℃，完成PCR；
(9)吸取5ul PCR產物，加2ul 5X DNA loading buffer；
(10)放在1％Agarose/TBE凝膠電泳孔中，進行電泳；
(11)用EB進行DNA染色，紫外線下觀察934bpDNA條帶；
(12)其余PCR產物，加100ul H2O，再加150ul苯酚、氯仿、異戊醇三者混合液，其中苯酚:氯仿:異戊醇為25:24:1，混合；
(13)離心，13000rpm,5分鐘；
(14)收取上清液，加15ul 5M NaCl,800ul乙醇，混合，-20℃，過夜；
(15)4℃條件下,離心，13000rpm,20分鐘；
(16)去除上清液，加800ul 70％乙醇，4℃條件下,離心，13000rpm,10分鐘；
(17)去除上清液，干燥微量離心管底部DNA，加50ul H2O溶解DNA；
上述構建FastBac-Flag-sST2質粒：
(1)用NdeI/XhoI內切酶切割DNA
混均，37℃反應2小時；
(2)放在1％Agarose/TBE膠電泳孔中，進行電泳
(3)EB進行DNA染色，紫外線下觀察934bp和4.6kb DNA條帶，分別切割下DNA條帶,分別放到1.5ml微量離心管中
(4)用QIAquick Gel Extraction Kit，提取Agarose條帶中DNA
步驟如下：
加700ul BufferQG到含DNA Agarose條帶微量離心管中，放在50℃，10分鐘，每2分鐘震蕩一次，溶解Agarose條帶
放QIAquick離心柱在2ml收集管中，加上述溶解液700ul到QIAquick離心柱中，放置2分鐘
離心，3000g 1分鐘,去除收集管中液體
再離心一次，3000g 1分鐘
加700ul Buffer PE到QIAquick離心柱
離心，12000g 1分鐘,去除收集管中液體
再離心一次，12000g 1分鐘，
放QIAquick離心柱在新微量離心管中，室溫下，放置5分鐘
加30ul H2O到QIAquick離心柱中，室溫下，放置3分鐘
離心，15000g 1分鐘
1.5ml微量離心管收集液中含有DNA，
用Nanodrop Spectrophotometer測定DNA濃度；
(5)用T4DNA ligase，連接PCR DNA片段pFastBac-Flag載體中，
在1.5ml微量離心管中加入以下物質；
混均，25℃，反應4小時；
(6)放微量離心管在冰塊上，加100ul感受態細菌，XL10 Gold細菌株，輕輕混合，冰塊上放置30分鐘
(7)放微量離心管在42℃水浴條件下，50秒，再放到冰塊上3分鐘
(8)加700ul LB培養液，37℃，搖動1小時
(9)離心，10000g,5分鐘，去除上清液，收集微量離心管底部細菌
(10)涂種在100ug/ml Ampicillin LB-瓊脂板上，37℃，培養過夜
(11)挑選單個菌落，接種到3ml100ug/ml Ampicillin LB培養液中，37℃，搖動，過夜
(12)提取細菌質粒DNA，用PureLink Quick Plasmid Miniprep Kits
加1.5ml細菌液到微量離心管中，離心，13000rpm3分鐘,去除上清液,
加250ul懸浮BufferR3到微量離心管中,均勻懸浮細菌
加250ul溶解BufferL7到微量離心管中,上下倒置微量離心管，放置微量離心管，室溫下，5分鐘
加350ul沉淀BufferN4到微量離心管中,上下倒置微量離心管，放置微量離心管在冰塊中，10分鐘
離心，13000rpm，10分鐘
放離心柱在2ml收集管中，加上述離心上清液到離心柱中，放置1分鐘，離心，12000g，1分鐘，去除收集管中液體
加洗滌500ul Buffer W10到離心柱中，放置1分鐘，離心，12000g，1分鐘，去除收集管中液體
加洗滌700ul Buffer W9到離心柱中，放置1分鐘，離心，12000g，1分鐘，去除收集管中液體
離心，12000g，1分鐘
放離心柱在新微量離心管中，室溫下，放置3分鐘
加75ul TE buffer到離心柱中，室溫下，放置3分鐘
離心，12000g 2分鐘
1.5ml微量離心管收集液中含有DNA
用Nanodrop Spectrophotometer測定DNA濃度；
(13)PstI內切酶，切割pFastBac-Flag-sST2 DNA
混均，37℃,反應2小時，
(14)放在1％Agarose/TBE膠電泳孔中，進行電泳
(15)EB進行DNA染色，紫外線下觀察形成DNA條帶；
(16)選出665bp DNA條帶質粒DNA，進行DNA序列測定,sST2 DNA測序引物，5’-tttttcatatggggttttggatcttagcaattc-3’；5’-tttttcatatgaagtttagtaaacaatcatggg-3’
(17)選擇出正確sST2 DNA序列的pFastBac-Flag-sST2載體。
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