[發明專利]一種高純度多殺菌素的提取方法

在審

• 申請號: 201711357879.5
• 申請日: 2017-12-17
• 公開（公告）號: CN109929004A
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 聞建華;傅紅
• 申請（專利權）人: 天津領世生物科技開發有限公司
• 主分類號: C07H17/08
• 分類號: C07H17/08;C07H1/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種高純度多殺菌素的提取方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）發酵液預處理：發酵結束后放罐前，加入1%硅藻土混均，用3~5 mol/L的氫氧化鈉溶液調節發酵液pH=11.5，然后將發酵液加熱升溫至45°C，保溫并以450r/min速度攪拌處理12小時；（2）用板框壓濾機進行壓濾，進行固液分離，收集菌絲體，收集菌絲體用90%極性有機溶劑進行充分溶解并用HCL溶液調節pH值至3.5攪拌運行，浸泡抽提菌絲體中的多殺菌素；用板框壓濾機進行壓濾，再次進行固液分離，收集浸提清液；（3）用純水稀釋收集浸提清液至有機溶劑溶度至60%，通過大孔吸附樹脂進行產物吸附，用65%-75%%的極性有機溶劑將大孔樹脂中吸附的多糖蛋白等雜質進行梯度洗脫，用90%的極性有機溶劑將大孔樹脂中吸附的多殺菌素產物進行解析，45°C條件下真空濃縮，揮發除去極性溶劑，得到多殺菌素濃縮液；（4）用NaOH溶液調節pH值=11，攪拌1小時靜置12小時使多殺菌素沉淀，過濾，用PH=10的稀堿液將多殺菌素沉淀洗滌1~3次，在45°C下真空干燥24小時，即得到90%以上多殺菌素粉劑粗品；（5)用多殺菌素粉劑粗品重量2倍1：1極性溶劑與純水的混合劑溶解多殺菌素粉劑粗品并用3~5 mol/L的磷酸溶液調節pH值至5.0上層析柱進行等度洗脫，分部收集98%以上多殺菌素純品，用旋轉蒸發器在45°C真空下脫除洗脫劑中的極性溶劑，用低介電常數或高碳醇萃取溶媒進行萃取，得到負載多殺菌素有機相，萃取條件為：萃取溶媒與多殺菌素濃縮液體積比=1:1~5，溫度20~45°C，pH=5.0~7.0，萃取時間5~10min；萃取完成分層后，收集負載有機相；（6）將負載有機相中加入純水進行反向萃取，反萃取條件為：負載有機相與純水體積比=1~5:1，純水PH=6.0~6.5，溫度20~30°C，反萃取時間5~8 min，反萃取級數為1~5；反萃取分層完成后收集反萃取相；將含有多殺菌素收集的反萃取相進行45°C真空旋蒸，脫除多余水分，形成油膏狀。

2.將脫除多余水分的多殺菌素油膏濃縮物放置-86°C凍干機進行冷凍干燥即得到99%以上高純多殺菌素粉劑。

3.根據權利要求1所述的第（2），（3），（4），（5）步中，所述極性溶劑為丙酮；第（3）步中，所述大孔吸附樹脂為HZ-818；第（5）步中，所述層析柱為高徑比10，柱的體積為上樣1g多殺菌素設計柱體積為200ml第（5）步中，所述層析柱洗脫劑為丙酮：水：磷酸，體積比為649:350：1；第（5）步中，所述低介電常數萃取溶媒為乙酸丁酯；所述高碳醇萃取溶媒為正辛醇；

根據權利要求1所述的收集菌絲體用90%極性有機溶劑進行充分溶解多殺菌素的工藝，其特征在于，所述第（2）步，發酵菌絲體與極性有機溶劑體積比=1:1.5，浸泡溫度為30~35°C，攪拌時間8小時。

4.根據權利要求1或2所述的用多殺菌素粉劑粗品重量2倍1：1極性溶劑與純水的混合劑溶解多殺菌素粉劑粗品并用3~5 mol/L的磷酸溶液調節pH值至5.0上層析柱進行等度洗脫工藝，其特征在于，所述第（4）步，層析柱洗脫劑為丙酮：水：磷酸，體積比為649:350：1，柱溫為常溫25~30°C，洗脫劑總量為層析柱體積的4~6倍，層析速率為4BV/h；

5.據權利要求1所述的第6步萃取溶媒與多殺菌素濃縮液體積比=1:3，萃取溫度30°C，萃取pH=6.5，萃取時間8 min。