[發明專利]一種親和層析分段洗脫純化胰蛋白酶的方法

在審

• 申請號: 201711357829.7
• 申請日: 2017-12-17
• 公開（公告）號: CN109929827A
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 劉乃山;夏襯來;張曉夢
• 申請（專利權）人: 青島冠龍生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/76
• 分類號: C12N9/76
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開一種親和層析分段洗脫純化胰蛋白酶的方法，該方法通過以下工藝步驟：（1）多重結晶;（2）活化；（3）鹽析；（4）超濾；（5）熱原處理；（6）透析；（7）親和層析；（8）凍干，制備胰蛋白酶。本發明對胰蛋白酶的生產工藝進行不斷改進，特別是對各工藝參數進行反復的實驗研究，不斷優化，最終確立了一套更為科學的規模化生產工藝，經親和層析純化所得的胰蛋白酶的效價高達1600～1900iu/mg,并且各項指標均符合中國藥典規定。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說涉及一種應用多重結晶、活化、鹽析、透析、親和層析等純化胰蛋白酶的方法。

背景技術

胰蛋白酶原的分子量約為24000，其等電點約為pH8. 9，胰蛋白酶的分子量與其酶原接近(23300)，其等電點約為pH10. 8，最適pH7. 6 8. 0，在pH = 3時最穩定，低于此pH時，胰蛋白酶易變性，在pH > 5時易自溶；Ca2+離子對胰蛋白酶有穩定作用。胰蛋白酶能催化蛋白質的水解，對于由堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸)的羧基與其他氨基酸的氨基所形成的鍵具有高度的專ー性。此外還能催化由堿性氨基酸和羧基形成的酰胺鍵或酯鍵，其高度專ー性仍表現為對堿性氨基酸一端的選擇。胰蛋白酶作為蛋白酶的ー種，不僅起消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活化作用。是特異性最強的蛋白酶，在決定蛋白質的氨基酸排列中，它成為不可缺少的工具。此外還有抗炎癥作用。臨床上用于膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創傷性損傷、瘺管等所產生的局部水腫、血腫及膿腫等。還可用于治療毒蛇咬傷，也常用于動物細胞培養前對組織的處理。用傳統的方法僅提取胰蛋白酶是相當困難的。2006年7月上海阿敏制藥有限公司公開了ー種糜胰蛋白酶的制備方法(200610023582. 0)，其采用低溫酸提、梯度鹽析、冰水透析、親和層析、こ醇醇析的產品エ 藝，得到糜胰蛋白酶。2011年I月馬忠仁等申請了ー種提取糜胰蛋白酶的方法(200910170682. X)，其采用了 CaCl2激活糜胰蛋白酶原成為糜胰蛋白酶的同時加入飽和度的(NH4)2SO4，使其生成硫酸鈣沉淀吸附糜胰蛋白酶，經過洗脫、鹽析、超濾和凍干獲得白色的糜胰蛋白酶的凍干粉末。產品均為糜胰蛋白酶，沒有單純的胰蛋白酶提取分離純化。

發明內容

本發明提供了一種親和層析分段洗脫純化胰蛋白酶的方法，是為了解決胰蛋白酶提取工藝蛋白活性損失嚴重的缺點，通過改變結晶條件進行多重結晶，結合超濾、透析、親和層析純化胰蛋白酶，較好的保持蛋白活性。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案予以實現：

一種親和層析純化胰蛋白酶的方法，其特征在于：改變結晶條件進行多重結晶，結合超濾、透析、親和層析等現代生物分離技術，將胰蛋白酶效價提高到1600～1900iu/mg，更好的保持了蛋白的活性。在發明技術方案中，其特征還在于所述提取工藝包括如下步驟：

1）多重結晶

1.1）結晶Ⅰ

核對胰蛋白酶粗品重量，加胰蛋白酶重量7倍（w/v）純化水攪拌溶解，加入少許硫酸攪拌，調節pH值至2.5～3.5；按2倍胰蛋白酶重量（w/v）加入飽和硫酸銨溶液，攪拌，調節pH值至4.5～5.5，置于25℃條件下，保溫，過濾，收集濾餅；

1.2）結晶Ⅱ

加濾餅重量3倍量（w/v）的純化水溶解，調節pH值至2.5～3.5；加濾餅重量1倍量（w/v）飽和硫酸銨溶液，攪拌，調節pH值至4.5～5.5，置于25℃條件下，保溫，過濾，收集濾餅；

1.3）結晶Ⅲ

加濾餅重量3倍量（w/v）的純化水溶解，調節pH值至2.5～3.5；加濾餅重量1倍量（w/v）飽和硫酸銨溶液，攪拌，調節pH值至4.5～5.5，置于25℃條件下，保溫，過濾，收集濾餅，濾液作母液回收；

1.4）母液回收Ⅲ