[發明專利]一種親和層析分段洗脫純化胰蛋白酶的方法

在審

• 申請號: 201711357829.7
• 申請日: 2017-12-17
• 公開（公告）號: CN109929827A
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 劉乃山;夏襯來;張曉夢
• 申請（專利權）人: 青島冠龍生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/76
• 分類號: C12N9/76
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種親和層析分段洗脫純化胰蛋白酶的方法，其特征在于，該方法包括：通過改變結晶條件進行多重結晶，結合超濾、透析、親和層析等現代生物分離技術，提高了純化胰蛋白酶的效率，保持胰蛋白酶的效價穩定。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于：以胰蛋白酶粗品為原料，依次經過多重結晶、活化、鹽析、超濾、熱原處理、透析、親和層析、凍干等工序純化得到胰蛋白酶。

3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述純化工藝包括如下步驟：

1）胰蛋白酶粗品溶解后，加入飽和硫酸銨溶液，過濾，收集濾餅；溶解濾餅，結晶，母液回收，收集濾餅；改變結晶條件，重復結晶3次；

2）溶解濾餅，加磷酸鹽緩沖液，加入活化劑活化；

3）活化液調節pH值后加入固體硫酸銨進行鹽析，靜置過夜，過濾，收集濾餅；

4）加入磷酸鹽緩沖液攪拌調節pH值，超濾；

5）超濾液加入磷酸鈉溶液和醋酸鈣溶液后，調節pH攪拌，離心，棄沉淀物；

6）取上述濾液置于透析袋中，透析4～6天；

7）親和層析，用2種洗脫液進行洗脫，最終收集含胰蛋白酶活性峰的洗脫液，-20℃保存；

8）調節pH值，裝盤、凍干，得胰蛋白酶。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，為了減少蛋白活性的損失，溶解胰蛋白酶和透析最好選用冰冷的純化水，4℃效果最佳。

5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，改變條件多次結晶，尤其是母液回收的工藝優化，提高了純化胰蛋白酶的效率，更好的保持了蛋白的活性。

6.如權利要求3所述的方法，其特征在于多重結晶中還應進行必要的母液回收，并且硫酸銨：母液=305g：1L，活化工序中每100mL待活化液中加入胰蛋白酶5mg，鹽析工序中每升活化液中加入500g硫酸銨。

7.如權利要求3所述的方法，其特征在于：所述親和層析快膠柱包括：苯基-Sepharose2B FF,苯基-Sepharose 4B FF,苯基-Sepharose 6B FF，苯基-Sepharose CL-2B FF,苯基-Sepharose CL-4B FF,苯基-Sepharose CL-6B FF。

8.如權利要求3所述的方法，其特征在于：所述親和層析條件為：平衡液選用含0.5-3mol/L (NH₄)₂SO₄的0.01-0.3mol/L，PH3-8的NaAc-HAc緩沖液,流速控制在1~5mL/min左右，洗脫液選用0.5-3mol/L 的(NH₄)₂SO₄溶液和不含(NH₄)₂SO₄平衡緩沖液。

9.如權利要求1～7所述的方法，其特征在于：親和層析純化所得胰蛋白酶效價高達1600～1900iu/mg。