[發(fā)明專利]一種糜蛋白酶的純化工藝

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711355040.8
• 申請日: 2017-12-16
• 公開（公告）號: CN109929826A
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉乃山;孫永發(fā)
• 申請（專利權(quán)）人: 青島冠龍生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/76
• 分類號: C12N9/76
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公布了一種糜蛋白酶的純化工藝。碎漿；鹽析，過濾；加入硫酸銨至0.4飽和度，冷室中放置過夜；過濾，用50kDa的超濾膜進行超濾；用5?10kDa的超濾膜進行超濾；濾液加硫酸銨至0.7飽和度，低溫放置過夜；過濾，析晶；活化；沉淀；用10kDa的超濾膜進行超濾；SP離子交換柱純化；用10?30kDa的超濾膜進行超濾，除菌，即得。使用超濾膜與離子交換柱的結(jié)合來純化糜蛋白酶，純化效果好，得到的產(chǎn)品純度高；本發(fā)明工藝得到的糜蛋白酶酶活性高，效價大于1500U/mg，可以減少用藥量，減少患者醫(yī)療支出，也提高了該酶的用藥安全性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)中糜蛋白酶領(lǐng)域，特別涉及一種糜蛋白酶的純化工藝。

背景技術(shù)

糜蛋白酶是從牛胰臟或豬胰臟中提取分離純化得到的一種蛋白酶。它能切斷蛋白質(zhì)肽鏈中酪氨酸和苯丙氨酸的羧端肽鏈，故能有效酶解蛋白質(zhì)，因而具有清創(chuàng)消膿，消化膿汁和去除壞死組織，助長新生肉芽生長的功能。在臨床上主要用于抗炎消腫，有報道稱其在輔助抗癌方面也具有不錯效果。此外，在皮革工業(yè)上，糜蛋白酶常用于脫去動物皮上的毛等。目前國內(nèi)已對該酶做了大量的研究，提取純化工藝多采用鹽析多重結(jié)晶結(jié)合透析的方法。鹽析多重結(jié)晶純化能力弱，耗費時間長；低溫激活耗費時間長，激活效率低；透析工藝耗時長，不便于工業(yè)化生產(chǎn)；且得到的產(chǎn)品純度低，雜蛋白多，增加了用藥的不良反應(yīng)； 傳統(tǒng)工藝所得產(chǎn)品的酶活性一般在1000-1200單位/毫克左右，產(chǎn)品純度為80-85%。酶活性低，產(chǎn)品中的雜蛋白增加了過敏反應(yīng)風(fēng)險。因此，提高糜蛋白酶的純度，提高其活性可以提高該酶的用藥安全性，是研究人員需關(guān)注的問題。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決以上糜蛋白酶活性含量低，純度低的問題，本發(fā)明提供了一種活性含量高、純度高的糜蛋白酶的純化工藝。本發(fā)明是通過以下方式實現(xiàn)的

一種糜蛋白酶的純化工藝，包括以下步驟

(1)取牛胰，將脂肪、結(jié)締組織除去，絞碎成胰漿；

(2)向胰漿中加入硫酸溶液進行鹽析，過濾；

(3)濾液中加入硫酸銨至0.4飽和度，冷室中放置過夜；

(4)過濾，濾液用截留分子量50kDa的超濾膜進行超濾；

(5)濾出液用截留分子量5-10kDa的超濾膜進行超濾；

(6)濾液加硫酸銨至0.7飽和度，低溫放置過夜；

(7)過濾，將濾餅溶于冷純化水中，冷純化水的體積數(shù)為濾餅質(zhì)量數(shù)的3-5倍，加硫酸調(diào)pH為2.0，攪拌使溶解，加入飽和硫酸銨溶液，飽和硫酸銨溶液的體積數(shù)為濾餅質(zhì)量數(shù)的 2倍，調(diào)pH至5.0，250℃，孵育2-5 h，有晶體析出，過濾收集晶體；

(8)晶體用冷純化水加硫酸溶解，冷純化水的體積數(shù)為晶體質(zhì)量數(shù)的3-5倍，調(diào)節(jié)pH7.6，加入胰蛋白酶，20℃活化2-4 h ；

(9)調(diào)節(jié)pH至4.0，加入固體硫酸銨使達0. 7飽和度，過濾收集沉淀；

(10)沉淀用冷純化水加硫酸溶解，用截留分子量10KDa的超濾膜進行超濾；

(11)將上述超濾脫鹽的料液加至已用0.05mol/L NaAC緩沖液平衡好的SP離子交換柱上，用3倍柱體積的含0.2 mol/L NaCl的緩沖液洗柱，用3倍柱體積的含0.4 mol/L NaCl的緩沖液洗脫得洗脫液；

(12)將上述洗脫液用截留分子量10-30kDa的超濾膜進行超濾，除菌，既得。所述的純化工藝，步驟(3)中濾液中加入硫酸銨至0. 4飽和度，加入硅藻土助濾。