[發明專利]一種糜蛋白酶的純化工藝

在審

• 申請號: 201711355040.8
• 申請日: 2017-12-16
• 公開（公告）號: CN109929826A
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 劉乃山;孫永發
• 申請（專利權）人: 青島冠龍生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/76
• 分類號: C12N9/76
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種糜蛋白酶的純化工藝，其特征在于所述方法包括以下步驟：(1)取牛胰，將脂肪、結締組織除去，絞碎成胰漿；(2)向胰漿中加入硫酸溶液進行鹽析，過濾；(3)濾液中加入硫酸銨至0.4飽和度，冷室中放置過夜；(4)過濾，濾液用截留分子量50kDa的超濾膜進行超濾；(5)濾出液用截留分子量5-10kDa的超濾膜進行超濾；(6)濾液加硫酸銨至0.7飽和度，低溫放置過夜；(7)過濾，將濾餅溶于冷純化水中，冷純化水的體積數為濾餅質量數的3-5倍，加硫酸調pH為2.0，攪拌使溶解，加入飽和硫酸銨溶液，飽和硫酸銨溶液的體積數為濾餅質量數的 2倍，調pH至5.0，250℃，孵育2-5 h，有晶體析出，過濾收集晶體；(8)晶體用冷純化水加硫酸溶解，冷純化水的體積數為晶體質量數的3-5倍，調節pH 7. 6，加入胰蛋白酶，20℃活化2-4 h ；(9)調節pH至4.0，加入固體硫酸銨使達0.7飽和度，過濾收集沉淀；(10)沉淀用冷純化水加硫酸溶解，用截留分子量10kDa的超濾膜進行超濾；(11)將上述超濾脫鹽的料液加至已用0.05mol/L NaAC緩沖液平衡好的SP離子交換柱上，用3倍柱體積的含0.2 mol/LNaCl的緩沖液洗柱，用3倍柱體積的含0.4 mol/L NaCl的緩沖液洗脫得洗脫液；(12)將上述洗脫液用截留分子量10-30kDa的超濾膜進行超濾，除菌，既得。

2.根據權利要求1所述的純化工藝，其特征在于步驟(3)中濾液中加入硫酸銨至0.4 飽和度，加入硅藻土助濾。

3.根據權利要求1所述的純化工藝，其特征在于步驟(7)中用5N NaOH調節pH至5.0， 加入的硫酸為5N的硫酸。

4.根據權利要求1所述的純化工藝，其特征在于步驟(8)中胰蛋白酶加入量為 5mg/100g晶體，加入晶體重量1倍的體積的pH 7.6的0.5 mol/L磷酸鹽緩沖液，以5N NaOH 調節pH 7.6。

5.根據權利要求1所述的純化工藝，其特征在于步驟(10)中超濾時添加pH3.0的冷純化水，至母液電導與0.05mol/L NaAC緩沖液電導相同為止。