[發(fā)明專利]一種CAR-T細(xì)胞的檢測(cè)探針及其檢測(cè)方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711353354.4
• 申請(qǐng)日: 2017-12-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108088783A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-05-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李鵬;湯朝陽(yáng);陳冬梅;秦樂(lè);王翠花;梁秋彬;林思妙
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南昭泰涌仁醫(yī)療創(chuàng)新有限公司
• 主分類號(hào): G01N15/14
• 分類號(hào): G01N15/14;G01N21/64
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發(fā)明提供了一種CAR?T細(xì)胞的檢測(cè)探針及其檢測(cè)方法和應(yīng)用所述探針包括能夠結(jié)合CAR?T細(xì)胞的配體，所述配體上修飾有量子點(diǎn)。本發(fā)明中，所述探針利用配體具有結(jié)合CAR分子的scFv結(jié)構(gòu)域的性質(zhì)，同時(shí)利用配體上修飾有不同種類或粒徑的量子點(diǎn)作為熒光標(biāo)記分子，不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)CAR?T細(xì)胞的精確靶向，而且實(shí)現(xiàn)了針對(duì)腫瘤細(xì)胞不同靶點(diǎn)的CAR?T細(xì)胞的高通量檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種CAR-T細(xì)胞的檢測(cè)探針及其檢測(cè)方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，CAR-T)是近年來(lái)熱門(mén)的血液性腫瘤的免疫治療方法，主要通過(guò)嵌合抗原受體T細(xì)胞(CAR-T細(xì)胞)進(jìn)行癌細(xì)胞抗原的識(shí)別和殺傷。CAR-T細(xì)胞是通過(guò)將識(shí)別腫瘤抗原的抗體的抗原結(jié)合部與CD3-ζ鏈或FcεRIγ的胞內(nèi)部分在體外偶聯(lián)形成的嵌合蛋白轉(zhuǎn)染入患者的T細(xì)胞，使患者自身的T細(xì)胞表達(dá)腫瘤特異性的嵌合抗原受體，進(jìn)行癌細(xì)胞清除。

嵌合抗原受體(CAR)是一個(gè)跨膜蛋白，胞外區(qū)用于識(shí)別癌細(xì)胞抗原，保證T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的精準(zhǔn)識(shí)別，當(dāng)CAR-T細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞后，CAR分子的胞內(nèi)區(qū)迅速激活T細(xì)胞，進(jìn)行靶細(xì)胞的凋亡和裂解。

近年來(lái)，CAR-T免疫療法在多個(gè)臨床試驗(yàn)中取得極佳的治療效果。報(bào)道稱，經(jīng)過(guò)CAR-T免疫療法，90％的急性淋巴細(xì)胞白血病患者得到完全緩解(S.L.Maude etal.Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions inleukemia.Engl.J.Med.,371,1507-1517(2014))。此外，CAR-T免疫療法還應(yīng)用于多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌等疾病的治療，并取得突出性成果。

CAR-T免疫療法的治療效果受到CAR-T細(xì)胞的活性和純度的影響，研究表明，CAR-T細(xì)胞在患者外周血中的增殖能力與治療效果具有很強(qiáng)的相關(guān)性。目前，主要通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)外周血基因組中CAR的表達(dá)量，間接估算CAR-T細(xì)胞的數(shù)量。然而，基因組中CAR的表達(dá)量與CAR-T細(xì)胞的數(shù)量不具有相關(guān)性，并且，CAR在基因組中的表達(dá)量受到載體種類、病毒滴度、細(xì)胞狀態(tài)等因素的影響，根據(jù)CAR的表達(dá)量進(jìn)行CAR-T細(xì)胞的數(shù)量的估算，誤差較大。

CN 105504042 A公開(kāi)了檢測(cè)CAR-T細(xì)胞的捕獲探針、該細(xì)胞含量的檢測(cè)方法及應(yīng)用，所述捕獲探針包括能夠結(jié)合在CAR-T細(xì)胞的配體，以及結(jié)合在該配體上的熒光分子。該探針及其檢測(cè)方法可快速準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞的檢測(cè)，為CAR-T監(jiān)測(cè)、預(yù)后提供有力保障。然而，該探針及其檢測(cè)方法僅用于針對(duì)單一靶點(diǎn)抗原的CAR-T細(xì)胞的檢測(cè)，而在CAR-T免疫療法的實(shí)際應(yīng)用中，需要采用針對(duì)腫瘤細(xì)胞不同靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合靶向，該探針及其檢測(cè)方法不能用于針對(duì)不同靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞的檢測(cè)，仍具有誤差。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的步驟，本發(fā)明提供了一種CAR-T細(xì)胞的檢測(cè)探針及其檢測(cè)方法和應(yīng)用，采用流式細(xì)胞技術(shù)實(shí)現(xiàn)了針對(duì)腫瘤細(xì)胞不同靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞的高通量檢測(cè)。

為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)CAR-T細(xì)胞的探針，所述探針包括能夠結(jié)合CAR-T細(xì)胞的配體，所述配體上修飾有量子點(diǎn)。

本發(fā)明中，所述探針利用配體具有結(jié)合CAR分子的scFv結(jié)構(gòu)域的性質(zhì)，進(jìn)行CAR-T細(xì)胞的捕獲，同時(shí)利用配體上修飾的量子點(diǎn)作為熒光標(biāo)記分子，結(jié)合流式細(xì)胞儀實(shí)現(xiàn)了對(duì)CAR-T細(xì)胞的檢測(cè)，而量子點(diǎn)在一定的電場(chǎng)或光壓下，根據(jù)種類和粒徑的不同，會(huì)發(fā)出不同頻率的光，且光穩(wěn)定性好，多色量子點(diǎn)不會(huì)出現(xiàn)光譜交疊，依據(jù)此性質(zhì)，通過(guò)采用標(biāo)記不同種類或粒徑量子點(diǎn)的探針，實(shí)現(xiàn)了針對(duì)腫瘤細(xì)胞不同靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞的高通量檢測(cè)。

優(yōu)選地，所述配體包括第一配體和第二配體。